楊 輝李鋒剛藍(lán)青景胡 偉劉小林王立新

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院, 楊凌 712100; 2. 陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 楊凌 712100)

大鯢鐵蛋白重鏈FTH基因的克隆、鑒定及表達(dá)分析

楊 輝1,2李鋒剛1,2藍(lán)青景1,2胡 偉1劉小林1王立新1,2

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院, 楊凌 712100; 2. 陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 楊凌 712100)

從大鯢皮膚cDNA文庫中, 篩選出大鯢鐵蛋白重鏈AdFTH的cDNA序列, 其全長為864 bp, 開放閱讀框?yàn)?31 bp, 編碼176個氨基酸, 5′和3′非翻譯編碼區(qū)(Untranslated region, UTR)分別為120 bp和214 bp, 預(yù)測蛋白質(zhì)的分子量為20.6 kD, 理論等電點(diǎn)PI為5.41, 預(yù)測蛋白無信號肽及跨膜結(jié)構(gòu), 在5′-UTR的22—51 bp處有一個特殊的鐵反應(yīng)元件(Iron response element, IRE)。同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明, 鐵蛋白重鏈在進(jìn)化上有著較高的保守性。實(shí)時定量PCR結(jié)果表明, 大鯢鐵蛋白重鏈mRNA在各個組織中廣泛表達(dá), 其中肝臟的表達(dá)量高于其他8種組織, 表明肝臟是大鯢主要的參與鐵儲存代謝的器官。成功構(gòu)建了大鯢鐵蛋白重鏈的重組表達(dá)載體pET32a-AdFTH, 利用大腸桿菌Escherichia coli BL21表達(dá)系統(tǒng)和Ni2+親和層析方法, 獲得了純度較高的重組大鯢鐵蛋白, 并證實(shí)重組大鯢鐵蛋白(Recombinant AdFTH protein, rAdFTH)具有氧化和吸收鐵離子的功能, 為進(jìn)一步制備AdFTH抗體了解其在大鯢體內(nèi)的多種作用機(jī)制打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

大鯢; 鐵蛋白重鏈; 序列分析; 原核表達(dá); 組織分布

在生物有機(jī)體中, 鐵元素參與了多種活動, 如氧的運(yùn)輸、DNA復(fù)制、電子傳遞、光合作用和細(xì)胞增殖等, 對維持細(xì)胞正常生長和代謝起著重要的作用[1]。但是, 細(xì)胞內(nèi)過高的鐵含量會對機(jī)體細(xì)胞造成一定的損傷和死亡[2]。因此對于生物體而言, 細(xì)胞內(nèi)鐵的代謝和其穩(wěn)態(tài)的維持有著重要的意義, 并由一類特定的蛋白質(zhì)完成[3]。

鐵蛋白(Ferritin)是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種鐵儲存和生物礦化蛋白質(zhì), 脊椎動物通常含有輕鏈(L)和重鏈(H)兩種鐵蛋白亞基, 兩棲類動物擁有另外一種鐵蛋白中型鏈(M), 而無脊椎動物只有一種與重鏈最為相似的亞基[4,5]。鐵蛋白的三維結(jié)構(gòu)是一個可容納鐵離子的球形結(jié)構(gòu), 在脊椎和無脊椎動物體內(nèi)均高度保守。鐵蛋白在功能上也具有較高的保守性, 其主要作用是結(jié)合、吸收細(xì)胞內(nèi)的鐵離子并使其礦化, 在維持機(jī)體鐵平衡中發(fā)揮著重要作用[6]。鐵蛋白的鐵以一種三價(jià)鐵離子氧化物的形式存在,不僅能儲存機(jī)體內(nèi)過剩的鐵, 為含鐵元素蛋白質(zhì)的合成提供鐵原子, 也可以防止鐵氧化過程中所產(chǎn)生的自由基帶來的傷害[7]。此外, 鐵蛋白還具有抗氧化功能及作為應(yīng)激和炎癥的反應(yīng)蛋白, 在機(jī)體免疫中也起著一定作用[8,9]。

中國大鯢(Andrias davidianus)俗稱娃娃魚, 隸屬于兩棲綱, 有尾目, 隱鰓鯢科, 是我國特有的大型珍稀兩棲動物, 也是現(xiàn)今世界上體形最大的兩棲動物。由于大鯢是野生動物從水生向陸生的過渡物種, 因此在研究物種起源、基因家族進(jìn)化上具有重要的研究價(jià)值。近年來, 大鯢也逐漸成為我國淡水養(yǎng)殖的一種經(jīng)濟(jì)種類, 不僅具有食用和藥用價(jià)值[10,11],而且有著極高的經(jīng)濟(jì)效益, 其養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展也具有一定規(guī)模。但是, 與其他物種相比, 有關(guān)中國大鯢的研究相對較少, 關(guān)于大鯢鐵蛋白ferritin基因的研究尚屬空白。因此, 研究大鯢在細(xì)胞代謝和生長發(fā)育中有重要作用的鐵蛋白ferritin具有著重要的意義。本文首次研究和報(bào)道了大鯢鐵蛋白ferritin一個亞基(鐵蛋白重鏈, AdFTH)同源基因的全長 cDNA序列,對其可能的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析和預(yù)測, 研究了在大鯢組織中的表達(dá)分布特征, 并利用大腸桿菌體外表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)了大鯢鐵蛋白, 分析重組蛋白活性,為認(rèn)識大鯢鐵蛋白和研究該分子的進(jìn)化和功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用的健康的3尾3齡以上大鯢(Andrias davidianus)購自陜西漢中天利大鯢養(yǎng)殖場。大鯢麻醉致死后, 在無菌條件下, 取肝臟、肌肉、皮膚、腎臟、脾臟、肺、心臟、胃、腸等組織樣, 迅速放入液氮中浸泡冷凍, 并用錫箔紙包裝放入–80℃保存,用于總RNA提取。

Escherichia coli BL21 (DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存, pET-32a(+)表達(dá)載體購自 Novagen公司, 大鯢皮膚cDNA文庫由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

大鯢鐵蛋白重鏈AdFTH 基因的序列分析 通過構(gòu)建大鯢皮膚 cDNA文庫, 挑選單克隆測序, 獲得大鯢鐵蛋白重鏈AdFTH (ferritin heavy chain)基因的全長cDNA序列。使用NCBI數(shù)據(jù)庫(http://blast. ncbi.nlm.nih.gov/)的Blastn 和Blastx軟件進(jìn)行基因同源性的搜索, 使用Vector NTI Suit 8.0軟件來分析序列的開放閱讀框及翻譯氨基酸序列, 利用signalP4.0在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/)和 TMHMM跨膜預(yù)測軟件(http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/)分別預(yù)測信號肽序列和跨膜區(qū)預(yù)測, 使用 ExPASy網(wǎng)站(http://prosite.expasy. org/)預(yù)測分析蛋白質(zhì)特性及可能的二級結(jié)構(gòu), 不同物種氨基酸序列的多重比對使用Clustal W 1.8軟件,系統(tǒng)進(jìn)化樹使用 MEGA 4.1軟件的鄰近法 NJ (Neighbor-joining tree)構(gòu)建, 設(shè)置1000次bootstraps進(jìn)行評估。

大鯢組織RNA 的提取及cDNA 的合成 取出于–80℃保存的組織樣, 迅速放入液氮中, 按照Trizol (Invitrogen)試劑盒說明書提取以上組織的總RNA, 并通過 1%的瓊脂糖凝膠電泳和核酸分析儀來檢測所提取RNA的質(zhì)量以及濃度。

cDNA合成采用PrimeScript? RT reagent Kit試劑盒(TaKaRa)。參照試劑盒說明, 取500 ng總RNA, 10 μL的反應(yīng)體系, 在37℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15min, 85℃滅活酶活性5s。

大鯢AdFTH 基因的組織表達(dá) 實(shí)時熒光定量PCR采用SYBR GreenⅠ染料法(SYBR?Premix Ex TaqTMII, TaKaRa), 在 Bio-Rad熒光定量 PCR儀CFX-96上進(jìn)行。反應(yīng)終體系為25 μL, 包括12.5 μL 2×SYBR Green Msater mix緩沖液, 150 ng DNA模板量, 正反引物各1.25 μL (10 μmol/L)。鐵蛋白重鏈基因的兩個特異性引物為FTH-F: 5'-ATGAGTGGAAC AACACCCT-3', FTH-R: 5'-GTCTCCAGGAAGTCA CAGAG-3', 擴(kuò)增產(chǎn)物為133 bp。選用β-actin作為內(nèi)參基因并設(shè)計(jì)特異性引物為β-actin-F: 5'-GCCAT CAATCGTCCACCG-3', β-actin-R: 5'-CCGCATCAA GCACCAGAA-3', 擴(kuò)增產(chǎn)物為132 bp。反應(yīng)條件為: 95℃ 3min; 95℃ 10s, 60℃ 30s, 40個循環(huán); 反應(yīng)完成后進(jìn)行熔解曲線分析, 95℃變性15s, 按0.1℃ /s的增速緩慢從 65℃升至 95℃。使用 CFX Manager Software采集數(shù)據(jù), 并且按照 2–△△Ct法來計(jì)算相對表達(dá)量。

pET32a-AdFTH 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)獲得的大鯢AdFTH全長cDNA序列與重組表達(dá)載體pET-32a(+)多克隆位點(diǎn)的特征, 設(shè)計(jì)引物 FTH-F: 5'-CCGGAATTC ATGGAGTCCCAGGTGCGC-3'(下劃線為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))FTH-R: 5'-CCGCTCGAGT TAGCTGCTCTCCCCCAT-3'(下劃線為XhoⅠ的酶切位點(diǎn))。以大鯢cDNA為模板, 利用FTH-F和FTH-R引物序列擴(kuò)增大鯢 FTH成熟肽序列。將純化后的PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體 pET-32a(+)分別用 EcoRⅠ、XhoⅠ進(jìn)行雙酶切處理, 用 1%的瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段和表達(dá)載體, 切膠純化。目的片段與表達(dá)載體在T4DNA連接酶的作用下, 16℃連接過夜。并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中, 涂布于終濃度為50 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上, 利用菌落PCR的方法篩選陽性克隆, 并進(jìn)行測序。

重組AdFTH蛋白的表達(dá)及純化 對經(jīng)檢測插入正確目的片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將篩選的工程菌接種至1 mL含氨芐青霉素濃度為50 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中, 37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)4—6h后, 并按照1∶50比例接種于200 mL LB培養(yǎng)基中, 37℃培養(yǎng)至 A600值至 0.6—0.8之間時, 加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。并分別于0、0.5、1、2、3、4、5h取樣, 5000 r/min 4℃離心10min,收集菌體, 并用無菌PBS緩沖液重懸菌體。經(jīng)超聲破碎后, 分別收集上清和沉淀, 加入上樣緩沖液煮沸后, 經(jīng)15%分離膠和5%濃縮膠SDS-PAGE進(jìn)行檢測。通過SDS-PAGE電泳, 分析重組大鯢鐵蛋白重鏈?zhǔn)且园w還是以可溶性存在。

10000 r/min 4℃離心10min, 收集上清液, 并負(fù)載上 Ni-NTA親和層析柱, 分別用 Soluble Binding Buffer (20 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L NaCl, 10 mmol/L咪唑, pH 7.9)和 Soluble Elution Buffer (20 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L NaCl, 500 mmol/L咪唑, pH 7.9)洗脫, 收集 Soluble Elution Buffer洗脫后的洗脫峰, 經(jīng) SDS-PAGE電泳檢測純化效果。

重組AdFTH 蛋白的活性檢測 利用Bradford方法, 對純化出來的重組大鯢鐵蛋白(Recombinant AdFTH protein, rAdFTH)進(jìn)行定量, 測定其濃度并用于活性檢測。根據(jù)Kim, et al.[12]研究的方法, 利用1%巰基乙酸的乙酸鈉溶液(0.1 mol/L, pH 5.5), 除去rAdFTH中的鐵離子, 通過2,2-聯(lián)吡啶螯合該溶液中的鐵離子并在Hepes緩沖液 (0.1 mol/L, pH 7.0)中透析。然后將20 μg/mL rAdFTH, 純化后的標(biāo)簽蛋白, 20 μg/mL的牛血清蛋白(BSA)在含有1 mmol/L硫酸亞鐵銨的0.1 mol/L Hepes中室溫孵育10min, 并于310 nm光度值處檢測OD值的變化。

2 結(jié)果

2.1 大鯢鐵蛋白重鏈AdFTH 基因cDNA 序列分析

從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的大鯢皮膚 cDNA文庫[13]中得到的 AdFTH cDNA全長 864 bp, 開放閱讀框(Open reading frame, ORF)長531 bp, 編碼176個氨基酸, 5′-UTR長120 bp, 3′-UTR長214 bp, 終止密碼子為 TAA, 3′末端存在加尾信號“AATAAA”, 在距離加尾信號19個核苷酸處有polyA的尾巴。開放閱讀框編碼蛋白的, 預(yù)測分子量大小為20.6 kD,理論等電點(diǎn)PI為5.41。利用SignalP4.0軟件分析,在其N末端沒有發(fā)現(xiàn)信號肽序列, TMHMM預(yù)測序列不存在跨膜結(jié)構(gòu), 序列中存在著一個潛在的 N-糖基化位點(diǎn)“N91-N-T-L”。在5'非編碼區(qū)核苷酸序列的22—51 bp的位置, 有個特殊的鐵反應(yīng)元件(IRE),并含有一個 CAGUGU序列。二級結(jié)構(gòu)分析表明,大鯢鐵蛋白重鏈?zhǔn)怯?段α螺旋組成, 可以形成一個4-bundle的螺旋結(jié)構(gòu), 在NCBI GenBank登錄號為JX195179。

2.2 大鯢鐵蛋白重鏈AdFTH 的多序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將大鯢鐵蛋白重鏈cDNA編碼的氨基酸序列與其他無脊椎動物和脊椎動物進(jìn)行多序列比對, 發(fā)現(xiàn)與金屬結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的7個殘基 (以大鯢的FTH氨基酸序列為例E24、Y31、E58、E59、H62、E104、Q138)呈現(xiàn)高度的保守性。

氨基酸序列同源性分析顯示, 大鯢與非洲爪蟾(Xenopus laevis)的鐵蛋白重鏈相似性最高, 達(dá)89.8%;與節(jié)肢動物的羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)、小 龍 蝦 ( Pacifastacus leniusculus)、 中 國 對 蝦(Fenneropenaeus chinensis)的同源性分別為 6 0.8%、51.4%、62.4%; 與硬骨魚類的斑點(diǎn)叉尾 鮰 (Ictalurus punctatus)、斑馬魚(Danio rerio)、金目鱸(Lates calcarifer)、文昌魚(Branchiostoma lanceolatum)的同源性分別為 7 1.2%、69.5%、71.2%、64.0%; 與雞(Gallus gallus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)的同源性分別為 71.8%、69.5%、68.4%、68.9%。利用Mega軟件臨近(NJ)法則, 經(jīng)1000次bootstraps計(jì)算, 構(gòu)建進(jìn)化樹。進(jìn)化樹分析表明, 所選動物的鐵蛋白重鏈氨基酸序列分為兩支, 脊椎動物為一支, 無脊椎動物為另一支, 脊椎動物的分支關(guān)系同物種的進(jìn)化關(guān)系保持一致, 大鯢鐵蛋白重鏈與非洲爪蟾的鐵蛋白重鏈聚為一支(圖1)。

圖1 鐵蛋白重鏈的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of the FTH amino acid sequence

2.3 大鯢鐵蛋白重鏈AdFTH 基因的組織表達(dá)分析

選擇大鯢的 β-actin基因作為內(nèi)參基因, 以AdFTH 基因特異性引物作為擴(kuò)增引物, 利用Quantitative Real-time PCR的方法檢測AdFTH基因在大鯢不同組織中的相對表達(dá)量。熔解曲線顯示為單一峰值, 表明無非特異性擴(kuò)增和引物二聚體。如圖2所示, AdFTH基因mRNA在所選的9個組織中均有表達(dá), 在肝臟中的表達(dá)量最高, 在皮膚、胃、肺、腸、肌肉中的表達(dá)量相對較低, 在心臟、腎臟、脾臟中的表達(dá)量介于兩者之間。

圖2 大鯢鐵蛋白重鏈的組織表達(dá)分析Fig. 2 Tissue distribution analyses of Andrias davidianus FTH

2.4 大鯢鐵蛋白重鏈AdFTH 原核表達(dá)及純化分析

將 EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切的目的片段和載體質(zhì)粒, 利用T4連接酶進(jìn)行連接, 并轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞中 BL21(DE3), 挑選陽性單克隆, 送華大基因公司測序。對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析, 挑選出正確的重組載體序列, 即確定重組載體 p ET32a-AdFTH構(gòu)建的正確性。

經(jīng) SDS-PAGE電泳檢測, 重組質(zhì)粒 pET32a AdFTH在大腸桿菌中高效表達(dá)異源蛋白。該重組蛋白分子量大小在 36.0 kD左右, 與預(yù)測的大鯢鐵蛋白(20.6 kD)和標(biāo)簽蛋白(Trx-tag、S-tag、His-tag; 共18.0 kD)之和大體一致, 重組表達(dá)載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后, 融合蛋白得到表達(dá), 而大腸桿菌沒有相應(yīng)的蛋白表達(dá)。同時, 對細(xì)菌裂解液的上清和沉淀分析表明, 重組融合蛋白是以可溶性的形式存在于上清中。利用 N i2+螯合親和層析柱純化上清中的重組蛋白, 用不同濃度的咪唑洗脫液進(jìn)行置換, 洗脫特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。SDS-PAGE檢測顯示, 只有一條分子量 36.0 kD左右的目的條帶, 并且無其他蛋白質(zhì)雜帶。-

2.5 重組鐵蛋白活性檢測分析

對純化出來的蛋白質(zhì), 利用Bradford方法進(jìn)行測定, 所測樣品光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較得出, 純化的重組鐵蛋白濃度為285.8 μg/mL, 并計(jì)算其菌體表達(dá)量為24.29 μg/mL。利用Kim, et al.的方法進(jìn)行rAdFTH活性檢測分析, 發(fā)現(xiàn)在 310 nm 處檢測rAdFTH的OD值為0.921(圖3), 明顯高于(P＜0.01)對照組BSA(0.113)和標(biāo)簽蛋白Tag (0.135), 表明重組大鯢鐵蛋白重鏈具有氧化吸收鐵離子的功能。

圖3 重組大鯢鐵蛋白重鏈活性檢測Fig. 3 The activity test of recombinant AdFTH protein

3 討論

3.1 大鯢鐵蛋白重鏈AdFTH cDNA 序列分析

本研究從構(gòu)建的大鯢皮膚cDNA文庫[13]中篩選得到大鯢鐵蛋白重鏈AdFTH同源基因的全長cDNA序列。在NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對, 結(jié)果顯示其核苷酸序列和氨基酸序列與熱帶爪蟾同源性均為90%, E值分別為5e–110和2e–116。信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)分析表明, 該序列無信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域。有研究指出,鐵蛋白可分為胞質(zhì)內(nèi)鐵蛋白和分泌型鐵蛋白[14], 且分泌型鐵蛋白以微量形式存在于脊椎動物的血液中[15]。在本研究中, 大鯢鐵蛋白重鏈的氨基酸序列中無信號肽及跨膜結(jié)構(gòu), 表明所篩選到的鐵蛋白為胞質(zhì)內(nèi)鐵蛋白。對比中華絨螯蟹[16]、中國對蝦[17]、文昌魚[18]及仿刺參[19]等動物鐵蛋白基因序列發(fā)現(xiàn), 大鯢AdFTH cDNA序列5′-UTR中同樣含有一個特殊的鐵反應(yīng)元件(IRE), 該元件是一個由CAGUGU序列形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)[20,21], 這預(yù)示著大鯢鐵蛋白重鏈 A dFTH的表達(dá)可能是通過鐵離子在翻譯水平上受到調(diào)控的。二級結(jié)構(gòu)分析表明, 大鯢鐵蛋白重鏈?zhǔn)怯?段α螺旋組成, 可以形成一個 4-bundle的螺旋結(jié)構(gòu), 而4-bundle的螺旋結(jié)構(gòu)是H亞基鐵氧化酶活性中心。

在人體內(nèi)的研究表明, 鐵蛋白氨基酸 E63、H66殘基和Y30、Y33、Y35殘基分別參與多晶體Fe復(fù)合物及亞鐵氧化酶中心形成[22], 而這些氨基酸殘基與大鯢鐵蛋白重鏈完全一致。氨基酸序列多重比對分析結(jié)果表明, 鐵蛋白的 7個與鐵離子結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基, 在大鯢和其他動物中均高度保守; 經(jīng)序列同源性分析, 與已報(bào)道的兩棲動物非洲爪蟾的鐵蛋白重鏈同源性最高, 與其他無脊椎動物和脊椎動物也有較高的相似性; 進(jìn)化樹分析結(jié)果也表明, 作為兩棲動物的大鯢與非洲爪蟾在進(jìn)化關(guān)系上最為接近, 同聚為一支, 其他鐵蛋白的進(jìn)化關(guān)系基本同物種進(jìn)化關(guān)系保持一致。據(jù)此, 從重要位點(diǎn)及結(jié)構(gòu)的保守性上可確認(rèn)所篩選的序列是大鯢鐵蛋白的 H亞基,并且該基因在進(jìn)化和功能上具有較高的保守性。

3.2 大鯢鐵蛋白重鏈AdFTH mRNA組織表達(dá)分析

在生物體內(nèi), 鐵蛋白不僅是主要的鐵調(diào)節(jié)蛋白,而且也是細(xì)胞用來抵抗應(yīng)激和炎癥的一種蛋白[8,23]。有研究表明, 鐵蛋白是一種急性時相反應(yīng)蛋白, 并在粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生過程中起到調(diào)節(jié)作用[24],對骨髓起源細(xì)胞、造血系統(tǒng)細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增殖有抑制作用[25]。不同物種的鐵蛋白mRNA組織分布和儲鐵器官是不一樣的, 通過對鐵蛋白mRNA在不同組織分布的研究, 能夠更有效地理解其作用機(jī)理及調(diào)控機(jī)制。在中華鱘中, 鐵蛋白mRNA在肝胰臟、肌肉、胃、心臟、鰓等多種組織均有表達(dá), 其中肝胰臟和心臟是參與鐵儲存的主要器官[26]; 在南美白對蝦中, 血細(xì)胞是參與鐵儲存代謝的主要器官, 鐵蛋白mRNA在血細(xì)胞、肝胰臟、眼柄、腹神經(jīng)節(jié)、胸神經(jīng)節(jié)等組織中均有表達(dá)[27]; 在合浦珠母貝中,其肌肉組織的mRNA有著較高含量[28]。本研究表明,大鯢鐵蛋白重鏈mRNA在大鯢肝臟、胃、肺、皮膚、肌肉、腸、腎、心臟、脾臟中均有表達(dá), 其中在肝臟中的表達(dá)量最高, 在皮膚、胃、肺、腸、肌肉中的表達(dá)量相對較低, 在心臟、腎臟、脾臟中的表達(dá)量介于兩者之間。鐵蛋白重鏈mRNA在各個組織中成廣泛性的組成型表達(dá), 可能與胞質(zhì)內(nèi)鐵蛋白的性質(zhì)有關(guān), 也暗示著可能參與多種生理功能[29,30]。在肝臟中的表達(dá)量最高, 可能與細(xì)胞核鐵蛋白主要存在于肝細(xì)胞等細(xì)胞中相關(guān)[31], 也表明肝臟是大鯢主要的鐵代謝和儲存器官。鐵蛋白有著一定的免疫功能, 而腎和脾臟作為動物體內(nèi)重要的免疫器官, 便解釋了大鯢鐵蛋白重鏈mRNA在腎臟和脾臟中的高效表達(dá)。與其他物種一致, 鐵蛋白的重鏈亞基(H),也稱作為心臟型, 在大鯢的心臟中也有著較高表達(dá)量。此外, 有研究報(bào)道指出, 鐵蛋白表達(dá)水平的異常與多種疾病密切相關(guān)[32,33]。鐵蛋白水平的增加既能反映干細(xì)胞破壞和炎癥程度, 也可作為肝臟代謝的功能性檢測指標(biāo)[34]。目前在大鯢上的研究相對較少,對相關(guān)疾病的檢測尚不完整, 通過對大鯢鐵蛋白研究的深入, 鐵蛋白很可能成為養(yǎng)殖動物疾病檢測的一個重要指標(biāo)[35]。

3.3 大鯢鐵蛋白重組表達(dá)分析

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有生長周期短、操作方便、培養(yǎng)簡單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn), 已成為許多異源蛋白質(zhì)的首選表達(dá)系統(tǒng)[36]。表達(dá)載體 pET-32a(+)具有 6個組氨酸標(biāo)簽?zāi)軌蚺c Ni2+高親和結(jié)合, 便于重組蛋白的純化。因此, 本研究選擇 pET-32a(+)為表達(dá)載體, 構(gòu)建了大鯢鐵蛋白重鏈 AdFTH的重組表達(dá)載體。SDS-PAGE結(jié)果顯示, 重組載體在IPTG誘導(dǎo)后,鐵蛋白重鏈在大腸桿菌中得到高效表達(dá), 經(jīng) Ni2+親和層析柱純化后, 在36.0 kD出現(xiàn)單一性條帶, 表明純化質(zhì)量較好。對純化出來的重組大鯢鐵蛋白進(jìn)行活性分析, 與對照相比, 重組大鯢鐵蛋白重鏈具有氧化吸收鐵離子功能, 與報(bào)道的重組文蛤鐵蛋白相一致[37], 表明本實(shí)驗(yàn)采用的原核表達(dá)體系能夠在體外獲得具有生物活性的重組大鯢鐵蛋白。在生物體內(nèi), 鐵蛋白除了儲存鐵離子的功能外, 還具有一定的機(jī)體免疫防御功能[30,38]。重組血吸蟲鐵蛋白研究表明, 其對抵抗應(yīng)激和炎癥也有一定作用[39]。此外有研究指出, 與鐵蛋白有著類似作用機(jī)理的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白, 表現(xiàn)出一定的抑菌作用[40], 但對鐵蛋白的研究還尚未報(bào)道。鐵蛋白所儲藏的鐵常以可溶性形式存在, 不具有毒性, 屬于具有生物利用價(jià)值的鐵源[41], 對外源鐵蛋白研究的深入, 為緩解鐵營養(yǎng)缺乏病提供了可能。另有研究發(fā)現(xiàn), 一些細(xì)胞吸收了外源的鐵蛋白后可增強(qiáng)抗氧化能力。鐵蛋白能夠增加對氧化損害的抵抗能力, 隨著更進(jìn)一步的研究,外源表達(dá)的鐵蛋白也許可作為一種飼料免疫添加劑,來增強(qiáng)機(jī)體的氧化能力, 提高機(jī)體免疫能力。

綜上所述, 本文從已構(gòu)建的大鯢皮膚cDNA文庫中成功篩選出大鯢鐵蛋白重鏈的全長cDNA序列,對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析, 表明鐵蛋白重鏈在進(jìn)化和功能上有一定的保守性。對其mRNA組織分布的研究發(fā)現(xiàn), 在大鯢肝臟中mRNA的含量最高, 表明肝臟是大鯢主要的參與鐵儲存和代謝的器官。利用原核表達(dá)系統(tǒng)和 Ni2+親和層析法, 已成功誘導(dǎo)并純化具有生物學(xué)活性的重組大鯢鐵蛋白重鏈, 為進(jìn)一步制備大鯢鐵蛋白抗體, 了解其在大鯢體內(nèi)的生物學(xué)活性及作用機(jī)制, 打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[1] Thomson A M, Rogers J T, Leedman P J. Iron-regulatory proteins, iron-responsive elements and ferritin mRNA translation [J]. International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 1999, 31(10): 1139—1152

[2] Reif D W. Ferritin as a source of iron for oxidative damage [J]. Free Radical Biology Medicine, 1992, 12(5): 417—427

[3] Aust S D. Ferritin as a source of iron and protection from iron-induced toxicities [J]. Toxicology Letters, 1995, 82—83: 941—944

[4] Xie M, Hermann A, Richter K, et al. Nitric oxide up-regulates ferritin mRNA level in snail neurons [J]. European Journal of Neuroscience, 2001, 13(8): 1479—1486

[5] Zhang Y, Meng Q, Jiang T, et al. A novel ferritin subunit involved in shell formation from the pearl oyster (Pinctada fucata) [J]. Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry& Molecularl Biology, 2003, 135(1): 43—54

[6] Wang D, Kim B Y, Lee K S, et al. Molecular characterization of iron binding proteins, transferrin and ferritin heavy chain subunit, from the bumblebee Bombus ignites [J]. Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecularl Biology, 2009, 152(1): 20—27

[7] Li M, Saren G, Zhang S. Identification and expression of a ferritin homolog in amphioxus Branchiostoma belcheri: evidence for its dual role in immune response and iron metabolism [J]. Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecularl Biology, 2008, 150(3): 263—270

[8] Torti F M, Torti S V. Regulation of ferritin genes and protein [J]. Blood, 2002, 99(10): 3505—3516

[9] Orino K, Lehman L, Tsuji Y, et al. Ferritin and the response to oxidative stress [J]. Biochemical Journal, 2001, 357(Pt 1): 241—247

[10] Ai W M , Chen S B, Zeng G Q, et al. Analysis of artificial simulation of ecological farming sub-second generation of Chinese giant salamander muscle nutrients [J]. Journal of Hydroecology, 2008, 1(6): 120—123 [艾為明, 陳少波, 曾國權(quán), 等. 人工模擬生態(tài)養(yǎng)殖子二代大鯢肌肉營養(yǎng)成分分析. 水生態(tài)學(xué)雜志, 2008, 1(6): 120—123]

[11] Wu G F, Tian W S, Huang Q Y, et al. Rare and economic amphibians in China [J]. Sichuan Journal of Zoology, 2000, 19(3): 192—195 [吳貫夫, 田婉淑, 黃慶云, 等. 中國珍稀及經(jīng)濟(jì)兩棲動物. 四川動物, 2000, 19(3): 192—195]

[12] Kim T Y, Joo I J, Kang S Y, et al. Paragonimus westermani: molecular cloning, expression, and characterization of a recombinant yolk ferritin [J]. Experimental Parasitology, 2002, 102(3—4): 194—200

[13] Wang L X, Zheng Y, Ai M, et al. Construction of cDNA library of Andrias davidanus skin tissue with analyzing the cDNA sequence and expression of Arpc5l gene [J]. Chinese Journal of Biochemistry Molecular Biology, 2011, 27(3): 273—281 [王立新, 鄭堯, 艾閩, 等. 大鯢皮膚cDNA文庫構(gòu)建及Arpc5l基因cDNA序列和組織表達(dá)分析. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2011, 27(3): 273—281]

[14] Huang T S, Law J H, Soderhall K. Purification and cDNA cloning of ferritin from the hepatopancreas of the freshwater crayfish Pacifastacus leniusculus [J]. European Journal of Biochemistry, 1996, 236(2): 450—456

[15] Linder M C, Madani N, Middleton R, et al. Ferritin synthesis on polyribosomes attached to the endoplasmic reticulum [J]. Journal of Inorganic Biochemistry, 1992, 47(3—4): 229—240

[16] Guo H Z, Fu J P, Chang M X, et al. Cloning and expression analysis of ferritin from Chinese mitten crab Eriocheir sinensis [J]. Journal of Fisheries of China, 2010, (6): 725—732 [郭慧芝, 付建平, 昌鳴先, 等. 中華絨螯蟹鐵蛋白基因的克隆及表達(dá)分析. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2010, (6): 725—732]

[17] Zhang J, Li F, Wang Z, et al. Cloning, expression and identification of ferritin from Chinese shrimp, Fenneropenaeus chinensis [J]. Journal of Biotechnology, 2006, 125(2): 173—184

[18] Li X Y, Zhang W, Lin Y S, et al. Sequence analysis, homology comparison and secondary structure prediction of ferritin protein gene in Qingdao amphioxus [J]. Journal of Shandong University, 2003, 38(5): 116—120 [李忻怡, 張偉,林浴霜, 等. 青島文昌魚鐵蛋白ferritin基因的序列分析、同源性比較及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測. 山東大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 38(5): 116—120]

[19] Yang A F, Zhou Z C, Sun D P, et al. Sequence and expression analysis of ferritin gene in Apostichopus japonJioucrnaal osf F ish[eriJes ]of .Ch ina, 2010, (6): 710—717 [楊愛馥, 周遵春, 孫大鵬, 等. 仿刺參鐵蛋白ferritin基因的序列分析及表達(dá). 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2010, (6): 710—717]

[20] Henderson B R, Menotti E, Bonnard C, et al. Optimal sequence and structure of iron-responsive elements. Selection of RNA stem-loops with high affinity for iron regulatory factor [J]. Journal of Biological Chemistry, 1994, 269(26): 17481—17489

[21] Munro H. The ferritin genes: their response to iron status [J]. Nutrition Reviews, 1993, 51(3): 65—73

[22] Beck G, Ellis T W, Habicht G S, et al. Evolution of the acute phase response: iron release by echinoderm (Asterias forbesi) coelomocytes, and cloning of an echinoderm ferritin molecule [J]. Developmental and Comparative Immunology, 2002, 26(1): 11—26

[23] Durand J P, Goundard F, Barbot C, et al. Ferritin and hemocyan: 210Po molecular traps in marine fish oyster lobster [J]. Marine Ecology Progress Series, 2002, 233: 199—205

[24] Broxmeyer H E, Bognacki J, Dorner M H, et al. Identification of leukemia-associated inhibitory activity as acidic isoferritins. A regulatory role for acidic isoferritins in the production of granulocytes and macrophages [J]. Journal of Experimental Medicine, 1981, 153(6): 1426—1444

[25] Broxmeyer H E. H-ferritin: a regulatory cytokine that down-modulates cell proliferation [J]. Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 1992, 120(3): 367—370

[26] Chen X W, Shi Z Y, Cheng Q Q. Cloning and tissue distribution analysis of full-length cDNA ferritin sequence in Chinese sturgeon Acipenser sinensis [J]. Zoological Research, 2009, 30(2): 144—150 [陳曉武, 施志儀, 程千千.中華鱘鐵蛋白基因cDNA全長克隆與組織表達(dá)分析. 動物學(xué)研究, 2009, 30(2): 144—150]

[27] Hsieh S L, Chiu Y C, Kuo C M. Molecular cloning and tissue distribution of ferritin in Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) [J]. Fish and Shellfish Immunology, 2006, 21(3): 279—283

[28] Zhang Y, Meng Q, Jiang T, et al. A novel ferritin subunit involved in shell formation from the pearl oyster (Pinctada fucata) [J]. Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecularl Biology, 2003, 135(1): 43—54

[29] Durand J P, Goudard F, Pieri J, et al. Crassostrea gigas ferritin: cDNA sequence analysis for two heavy chain type subunits and protein purification [J]. Gene, 2004, 338(2): 187—195

[30] Recalcati S, Invernizzi P, Arosio P, et al. New functions for an iron storage protein: the role of ferritin in immunity and autoimmunity [J]. Journal of Autoimmunity, 2008, 30(1—2): 84—89

[31] Cheepsunthorn P, Palmer C, Connor J R. Cellular distribution of ferritin subunits in postnatal rat brain [J]. Journal of Comparative Neurology, 1998, 400(1): 73—86

[32] Huang C W, Bai L, Cui S D, et al. Study on the relationship between serum iron, serum ferritin and fatty liver [J]. Chinese Journal of Digestion, 2003, 23(4): 211—212 [黃聰武, 白嵐, 崔生達(dá), 等. 血清鐵、鐵蛋白和脂肪肝關(guān)系的研究. 中華消化雜志, 2003, 23(4): 211—212]

[33] Shao F, Zhu F Q, Li C J. Clinical meaning of serum ferritin, iron in chronic hepatitic B [J]. Journal of Xi’an Jiaotong University (Medical Science), 2006, 27(3): 292—294 [邵飛, 朱鳳群, 李春姬. 慢性乙型病毒性肝炎血清鐵及鐵蛋白檢測. 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2006, 27(3): 292—294]

[34] Qu R, Liu R, Xie Y B, et al. Research advance in ferritin expression on chronic liver diseases and liver cancer [J]. Medical Recapitulate, 2009, 15(23): 3545—3548 [屈銳, 劉銳, 謝云波, 等. 鐵蛋白在慢性肝病和肝癌中表達(dá)情況的研究進(jìn)展. 醫(yī)學(xué)綜述, 2009, 15(23): 3545—3548]

[35] Orino K, Watanabe K. Molecular, physiological and clinical aspects of the iron storage protein ferritin [J]. Veterinary Journal, 2008, 178(2): 191—201

[36] Manning D S, Leong J C. Expression in Escherichia coli of the large genomic segment of infectious pancreatic necrosis virus [J]. Virology, 1990, 179(1): 16—25

[37] Yao X L, Sun J S, Zhang Q, et al. Recombinant expression and tissue distribution analysis of ferritin in Meretrix meretrix [J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2011, 42(6): 863—867 [姚學(xué)良, 孫金生, 張勤, 等. 文蛤(Meretrix meretrix)鐵蛋白的重組表達(dá)及其組織表達(dá)特征分析. 海洋與湖沼, 2011, 42(6): 863—867]

[38] Gueguen Y, Cadoret J P, Flament D, et al. Immune gene discovery by expressed sequence tags generated from hemocytes of the bacteria-challenged oyster, Crassostrea gigas [J]. Gene, 2003, 303: 139—145

[39] Wang M, Yi X Y, Zeng X F, et al. Schistosoma japonicum recombinant ferritin: expression, purification and its protective immunity against Schisyosoma japonicum in mice [J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2004, 20(2): 113—116 [王敏, 易新元, 曾憲芳, 等. 重組日本血吸蟲鐵蛋白的表達(dá)純化及誘導(dǎo)小鼠保護(hù)性免疫研究. 中國人獸共患病雜志, 2004, 20(2): 113—116]

[40] Gao M Y, Zhu X P, Shi Y, et al. Recombinant expression and antimicrobial activity analysis of transferring in asian yellow pond turtle [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2012, 36(5): 892—897 [高明英, 朱新平, 史燕, 等. 黃喉擬水龜轉(zhuǎn)鐵蛋白重組表達(dá)及抗菌活性分析. 水生生物學(xué)報(bào), 2012, 36(5): 892—897]

[41] Liu Q Q, Yao Q H, Wang H M, et al. Endosperm-specific expression of the ferritin gene in transgentic rice (Oryza sativa L.) results in increased iron content of milling rice [J]. Acta Genetica Sinica, 2004, 31(5): 518—524 [劉巧泉, 姚泉洪, 王紅梅, 等. 轉(zhuǎn)基因水稻胚乳中表達(dá)鐵結(jié)合蛋白提高稻米鐵含量. 遺傳學(xué)報(bào), 2004, 31(5): 518—524]

CLONING, IDENTIFICATION AND EXPRESSION OF FERRITIN HEAVY CHAIN FROM CHINESE GIANT SALAMANDERS, ANDRIAS DAVIDIANUS

YANG Hui1,2, LI Feng-Gang1,2, LAN Qing-Jing1,2, HU Wei1, LIU Xiao-Lin1and WANG Li-Xin1,2
(1. College of Animal Sciences, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture, Yangling 712100, China)

Ferritin is an important iron storage protein in organism with the function of detoxification, anti-inflammatory and anti-stress. In this study, the full length cDNA of Andrias davidianus ferritin heavy chain (AdFTH) was isolated from the constructed skin cDNA library, and it consists of 864 bp including an open reading frame (ORF) of 531 bp, a 5′-terminal untranslated region (UTR) of 120 bp, and a 3′-UTR of 214 bp. The predicted molecular weight is 20.6 kD and the theoretical isoelectric point is 5.41 with no amino-terminal signal peptide and transmembrance domain. A complete iron-responsive element (IRE) locates at the 5′-UTR corresponding to the nucleotide sequence at the positions of the 22—51 bp. The homology and phylogenetic analysis of FTH among other animals indicated that it is an evolutionarily conserved gene. The results of quantitative real time PCR demonstrated that AdFTH was ubiquitously expressed, and the highest level of adFTH was observed in the liver from total 9 tissues, which may support that the liver is the major organ for the storage and metabolism of iron in Andrias davidianus. Additionally, a recombinant expression vector pET32a-AdFTH was constructed, and the recombinant protein was purified using the expression system in E. coli BL21 (DE3) pLysS and Ni2+-chelating chromatography. The purified recombinant AdFTH protein (rAdFTH) promoted iron oxidation and iron uptake in vitro, suggesting that the rAdFTH protein may be used to produce the monoclonal antibodies and provide a foundation for further investigation of the physiological function of AdFTH.

Andrias davidianus; Ferritin heavy chain; Sequence analysis; Tissue distribution; Prokaryotic expression

786

A

1000-3207(2014)01-0027-08

10.7541/2014.04

2012-10-08;

2012-11-22

陜西省科技攻關(guān)(2012K01-18); 西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(QN2011062); 西北農(nóng)林科技大學(xué)后稷學(xué)者支撐計(jì)劃(Z11021007)資助

楊輝(1988—), 男, 河南南陽人; 研究生; 主要從事水產(chǎn)動物資源保護(hù)與利用。E-mail: victor1900@nwsuaf.edu.cn

王立新(1968—), 男, 副教授, 碩士研究生導(dǎo)師; E-mail: fisherwanglx@163.com