方 琳， 姚 帥， 崔亞君*， 吳婉瑩

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)， 上海 201203， 2.中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所， 上海 201203）

［綜 述］

二維薄層色譜技術(shù)的研究進(jìn)展

方 琳1， 姚 帥2， 崔亞君1*， 吳婉瑩2

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)， 上海 201203， 2.中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所， 上海 201203）

二維薄層色譜是一種新型的薄層色譜技術(shù)，主要包括單固定相二維薄層色譜、雙固定相二維薄層色譜和二維移植薄層色譜。本文通過查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，對(duì)不同二維薄層色譜技術(shù)的操作方法及特點(diǎn)、二維薄層色譜圖像處理、與其他技術(shù)聯(lián)用的進(jìn)展進(jìn)行了介紹，并對(duì)其未來發(fā)展提出了展望。二維薄層在保留了一維色譜的所有優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，大大擴(kuò)充了峰容量，提高了分離效果，可為中藥質(zhì)量控制的發(fā)展研究提供新的思路。

二維薄層色譜；中藥；單固定相二維薄層色譜；雙固定相二維薄層色譜；二維移植薄層色譜

薄 層 色譜法 （ thin layer chromatography， TLC） 是 被 廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域的一種常用技術(shù)，在監(jiān)測(cè)中藥分離純化，中藥材、制劑的定性鑒別和質(zhì)量控制等方面一直發(fā)揮著不可替代的作用。中藥具有成分復(fù)雜多樣的特點(diǎn)，有些藥材種屬來源眾多，因此在中藥材的采收、加工、流通等過程中容易出現(xiàn)偽劣摻假等行為。中藥現(xiàn)代化主要是以現(xiàn)代化各種分離技術(shù)反映中藥整體輪廓特征。但普通薄層色譜的峰容量十分有限，在中藥等成分復(fù)雜樣品的分析過程中顯得力不從心， 于是， 一種更為先進(jìn)的薄層色譜技術(shù)——二維薄層 色譜 （ two-dimensional thin-layer chromatography， 2DTLC） 應(yīng)運(yùn)而生。

二維薄層色譜應(yīng)當(dāng)滿足兩個(gè)條件：兩個(gè)維度的分離機(jī)制是相互正交的；在第一維中已被分離開的兩個(gè)物質(zhì)在第二維展開的過程中依然是分離的［1］。 其在擴(kuò)充峰容量提高分離效果的基礎(chǔ)上，幾乎保留了一維色譜的所有優(yōu)點(diǎn)：采用一次性固定相，樣品通常無(wú)需凈化精制，節(jié)約分析成本和時(shí)間；結(jié)果可視化；所需展開劑量少，節(jié)約試劑；固定相和流動(dòng)相選擇范圍廣；所有斑點(diǎn)貯存在薄層板上，可隨時(shí)對(duì)其重復(fù)掃描檢測(cè)， 得出最佳結(jié)果［2］。 1994 年至今共有26 篇相關(guān)研究論文發(fā)表 （見表 1）， 本文據(jù)此對(duì)二維薄層色譜進(jìn)行綜述。

表1 二維色譜相關(guān)研究論文發(fā)表趨勢(shì)

1 二維薄層色譜分類

根據(jù)近年來國(guó)內(nèi) （見表 2） 和國(guó)外 （見表 3） 的實(shí)驗(yàn)研究，較為常用的二維色譜大致有3種，單固定相二維色譜、雙固定相二維色譜以及二維移植色譜。

1.1 單固定相二維薄層色譜 單固定相二維薄層色譜（2D-TLC on one absorbent）， 即薄層板只有一種固定相涂層。樣品在薄層板的一角點(diǎn)狀點(diǎn)樣，在第一個(gè)方向上展開，晾干之后， 旋轉(zhuǎn) 90°， 在第二個(gè)方向上再次展開［3］。

為達(dá)到較好的分離效果，一般可選擇中等極性的固定相，并在兩個(gè)方向上使用不同的溶劑系統(tǒng)，使兩個(gè)維度分別為正相展開系統(tǒng)和反相展開系統(tǒng)。當(dāng)然，理論上也可以在兩個(gè)維度上都使用相同的展開系統(tǒng)，但這樣只是相當(dāng)于延長(zhǎng)了展距，對(duì)分離效果并無(wú)明顯的提升，因此較少被采用。

這里存在著一個(gè)問題，由于兩次展開都在同一塊薄層板上進(jìn)行，因此第一維所使用的展開劑很可能會(huì)對(duì)固定相的性質(zhì)造成一定的影響，為了避免這種情況的發(fā)生，在兩次展開之間的流動(dòng)相去除步驟十分關(guān)鍵。倘若第一維展開劑中含水，則干燥過程將十分耗時(shí)，且很難控制薄層板的含水量，故建議將含水展開劑放在第二維，以確保方法的重現(xiàn)性。

1.2 雙固定相二維薄層色譜 雙固定相二維薄層色譜（2D-TLC on bilayer plates）， 即薄層板鋪有兩種不同的固定相涂層，一種涂層為一窄條帶，薄層板的剩余空間鋪滿另一種涂層。樣品在條帶涂層的一端點(diǎn)狀點(diǎn)樣，在第一個(gè)方向上展開， 晾干之后， 旋轉(zhuǎn) 90°， 在第二種涂層上進(jìn)行展開［4］。 第一維固定相還能起到預(yù)濃縮的作用， 使第二維展開的條帶更細(xì)，展開結(jié)果更為美觀。

雙固定相二維色譜也和單固定相二維色譜存在著相同的問題，即兩次展開過程之間的干燥問題，但其問題更為嚴(yán)峻，單固定相二維色譜尚可選擇將反相系統(tǒng)在第二維展開，但雙固定相二維色譜的兩個(gè)維度已被預(yù)制，第一維若為十二烷基硅膠之類的固定相，則只能選擇將反相展開系統(tǒng)作為第一維，無(wú)法回避控制含水量的問題。

表2 二維薄層色譜技術(shù)國(guó)內(nèi)進(jìn)展

表3 二維薄層色譜技術(shù)國(guó)外進(jìn)展

1.3 二維移植薄層色譜 二維移植薄 層色譜 （ graft-TLC）與雙固定相二維色譜有些許相似，也是在第一維的固定相展開之后， 旋轉(zhuǎn) 90°， 將樣品在另一種固定相上進(jìn)行展開，但不同之處在于兩種固定相是相互獨(dú)立的，樣品從第一相到第二相的轉(zhuǎn)移是通過將兩塊薄層板面對(duì)面放置，部分重合后用夾子固定住，利用洗脫能力較強(qiáng)的展開劑將樣品從第一維固定相中推至第二維固定相中［4］。

二維移植色譜可實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品同時(shí)展開，只需在第一維展開時(shí)將樣品并列點(diǎn)在同一塊薄層板上，展開過程結(jié)束之后沿著展開方向?qū)⒈影宀贸瑟M窄條帶，下一步分別轉(zhuǎn)移至各自的相同或不同的第二維固定相進(jìn)行展開即可。

二維移植色譜與前兩種二維色譜相比，有更為廣泛的固定相類型可供選擇，可在不同的分離維度上選擇不同的固定相進(jìn)行組合，取得更為理想的分離效果。

1.4 其他二維薄層 除了上述 3 種方法， 還有一些未被廣泛應(yīng)用的二維薄層技術(shù)。

在第一維展開結(jié)束之后，有時(shí)很難找到一種合適的展開劑在第二維對(duì)所有的物質(zhì)都能好的分離效果，有人提出了一種在單固定相二維薄層的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)的展開方式，在第一維結(jié)束之后，將薄層上的樣品延著第二維的方向劃成幾個(gè)組分，通過每次保留特定組分的底部固定相而劃除其他組分的底部固定相，以保證每次只有一個(gè)組分被其專屬展開劑所展開，達(dá)到每個(gè)組分獨(dú)立展開的目的，其分離效果較單固定相二維薄層有了很大的提高［5］。 這種方法雖然是一種新穎有趣的二維薄層技術(shù)，但其操作過程較為繁瑣，在固定相的劃除過程中，不同人之間操作的偏差較大，對(duì)其展開結(jié)果影響較大。

另有一種二維薄層，將兩塊涂層不同的條狀薄層板面對(duì)面放置，部分重合后用夾子固定住，樣品在第一維展開結(jié)束之后直接進(jìn)入第二維展開［6］。 這種薄層展開方式雖然在分離方向上不垂直，但其分離機(jī)制正交，也可以被納入二維色譜的范疇，且這種展開方式效果優(yōu)于單固定相二維薄層。

2 圖像處理技術(shù)

采用薄層色譜法分析樣品后，獲得的輪廓圖可以通過攝像以圖片的形式保存。傳統(tǒng)的方式是一般通過保存的圖像得到直觀的視覺感官信息，尋找待測(cè)樣品的特征斑點(diǎn)，并對(duì)不同來源的樣品進(jìn)行辨別，此外，也可以通過其他方式來獲得更為豐富的數(shù)據(jù)信息。

一種方法是通過向?qū)I(yè)軟件導(dǎo)入薄層照片得到相應(yīng)的色譜峰信息。在導(dǎo)入之前，應(yīng)對(duì)圖像進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，減少由于拍攝過程中光線等影響造成的圖像失真等情況。二維薄層的圖像預(yù)處理與一維色譜相似，也可通過灰度變換、去噪、平滑、銳化等預(yù)處理方式達(dá)到圖像復(fù)原、增強(qiáng)等目的，以便于在下一步的分析如聚類分析中取得更為客觀的結(jié)果［23，28-29］。 薄層色譜 在很多時(shí)候被認(rèn)為 是一種定性或半定量技術(shù)，其實(shí)，如果能夠經(jīng)過適當(dāng)?shù)膱D像處理，尤其是扣除背景，定義斑點(diǎn)邊緣之后，其不失為一種很好的定量技術(shù)［30］。

此外，運(yùn)用薄層掃描儀可在紫外光或可見光下得到薄層圖譜中特征斑點(diǎn)的類似液相的保留時(shí)間與峰面積的對(duì)應(yīng)信息。目前的二維薄層掃描使用的是與一維薄層相同的掃描儀， 在一個(gè)薄層平面上最多只能呈現(xiàn) 36 條掃描通路［20-21，26-27］， 這對(duì)峰容 量 較大， 樣品斑 點(diǎn) 分 布 較 為 集 中 的二維色譜來說還不夠，需要有更為先進(jìn)的掃描儀器提供相同面積下更為豐富的掃描通路來展現(xiàn)二維薄層色譜最佳的視覺效果。

對(duì)于二維薄層圖像處理， Matlab 和 Image J是目前應(yīng)用最為廣泛 的 軟件。 ?ukasz Komsta［23］等人通 過 Image J對(duì) 單固定相二維薄層的結(jié)果圖像進(jìn)行了一系列的處理，成功地使斑點(diǎn)得到了客觀準(zhǔn)確的聚類分析結(jié)果。

3 與其他技術(shù)聯(lián)用

通過薄層色譜得到的樣品整體數(shù)據(jù)輪廓，可以對(duì)不同種屬植物來源藥材或相近品種進(jìn)行鑒別，但要說清楚其不同的特征成分，需要對(duì)樣品的特征斑點(diǎn)的化合物或一類化合物進(jìn)行成分識(shí)別，除了傳統(tǒng)的離線方式將斑點(diǎn)成分逐一提取出來，然而近年來，薄層色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)嘗試了一種在線的成分識(shí)別方法。其中，應(yīng)用最多的是電噴霧解吸電離技術(shù)：電噴霧的發(fā)射器在距離薄層板2 mm左右的高度并呈一定的角度將帶電離子打到薄層板上，待測(cè)樣品從固定相表面解吸出來并被電離，從而進(jìn)入質(zhì)量分析器獲得質(zhì)譜圖［22，31］。 現(xiàn)有的薄層 質(zhì) 譜 聯(lián) 用 技 術(shù) 尚 存 在 一 些 不 足，如待分析斑點(diǎn)濃度較低，不足以獲得特征分子量及碎片離子，質(zhì)譜從薄層板上直接收集待測(cè)斑點(diǎn)的空間分辨率較低。

還可以和其他色譜技術(shù)如氣相色譜 （GC）、 超臨界流體色譜 （SFC）、 高效液相色譜等進(jìn)行聯(lián)用， 但要實(shí)現(xiàn)與這些色譜的聯(lián)用，需要解決如何將第一維所得化合物組分引到薄層板上的問題。

目前二維薄層色譜與其他技術(shù)的聯(lián)用對(duì)儀器設(shè)備的要求較高，現(xiàn)有的方法并非所有的實(shí)驗(yàn)室都能夠?qū)崿F(xiàn)，隨著二維薄層被更多的研究者所認(rèn)識(shí)和重視，我們期待更多它與其他技術(shù)的聯(lián)用方式的出現(xiàn)。

4 二維薄層色譜展望

我國(guó)學(xué)者早在上個(gè)世紀(jì)90年代就已開始進(jìn)行二維薄層色譜的相關(guān)研究 （見表 2）， 多集中于單固定相二維薄層，將其應(yīng)用于單味中藥及中藥復(fù)方成藥的研究。雖然在研究過程中取得了較好的分離效果，但展開方式較為單一，且由于當(dāng)時(shí)儀器設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)陋，對(duì)結(jié)果的處理方式還停留在一維薄層色譜水平階段，并未建立與二維薄層色譜技術(shù)相適應(yīng)的圖像分析和數(shù)據(jù)處理方法，更沒有系統(tǒng)的成分識(shí)別方法，對(duì)其的應(yīng)用也僅僅局限在作為一種化合物分離技術(shù)，并未挖掘出其在中藥質(zhì)量控制方面存在的巨大潛能，和在其他方面的應(yīng)用價(jià)值，因此并未在國(guó)內(nèi)研究者中得到足夠的重視，這些可能是今年來國(guó)內(nèi)二維薄層色譜研究工作相對(duì)停滯的原因。

而國(guó)外學(xué)者對(duì)二維薄層色譜的研究則顯得更加豐富化（見表3）， 開發(fā)出各種展開方式， 形成多種圖像處理方法，將其廣泛地應(yīng)用于生物化學(xué)、生物學(xué)、天然藥物的分離分析，并且仍在不斷地進(jìn)行新的嘗試和探索。

二維薄層色譜的峰容量理論上可達(dá) 100 到 250［1］， 但國(guó)內(nèi)外的二維薄層色譜研究中均未實(shí)現(xiàn)過如此高的峰容量，表明二維色譜薄層的理論和技術(shù)還有很多值得探索之處。

由于供試品和對(duì)照品不能在同一塊薄層板上進(jìn)行展開，因此斑點(diǎn)的指認(rèn)有一定的難度，需要每次展開具有較高的重復(fù)性，但目前的二維薄層色譜在兩個(gè)維度之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換的步驟尚需人力操作，重復(fù)性難免不高，故開發(fā)合適的色譜專用展開裝置甚至自動(dòng)裝置十分有必要。已有人嘗試對(duì)二維展開裝置進(jìn)行了相關(guān)研究［32］， 但目前市場(chǎng)上還并未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)產(chǎn)品，其仍有較大的開發(fā)潛力。

作為復(fù)雜體系，即使單味中藥，其化學(xué)組分也極其龐大， 常多于 100 種， 對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制研究是目前中藥研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。目前已有的質(zhì)控方法多針對(duì)于少數(shù)幾個(gè)特征成分，難以滿足近年我國(guó)藥典修訂大綱提出的整體質(zhì)量控制的要求，而二維薄層色譜不僅僅是一種優(yōu)秀的分離技術(shù)，其極高的峰容量是一維薄層和一維液相所無(wú)法媲美的，且其結(jié)果重現(xiàn)性也較高，在中藥復(fù)雜成分質(zhì)控研究中擁有極大的發(fā)展空間。值得引起注意的是，美國(guó)藥典已經(jīng)在食品補(bǔ)充劑一冊(cè)中的西洋參等中藥的監(jiān)測(cè)方法中應(yīng)用了單固定相二維薄層，使二維薄層色譜的質(zhì)控能力得到了很好的證明。美國(guó)藥典注重以更加先進(jìn)的方法更加全面地對(duì)可監(jiān)測(cè)到的所有成分即整體輪廓進(jìn)行質(zhì)量控制，并以實(shí)際行動(dòng)邁出了這一步，我們有理由相信，在不久的將來，這也會(huì)成為我國(guó)中藥復(fù)雜體系整體輪廓質(zhì)量控制的發(fā)展方向。

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： 1001-1528（2014）03-0589-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.031

2013-07-08

方 琳 （1989—） ， 女， 碩士生， 研究方向： 中藥學(xué)。 Tel： 13818459120， E-mail： fanglincorn@126.com

*通信作者：崔亞君，女，副教授，研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。