盧亞玲，王小楠，劉文杰 *，賈清華，蘆倩雯

（1.塔里木大學 生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300；3.塔里木大學分析測試中心，新疆 阿拉爾 843300）

啤酒花（Humulus lupulusL.）又名忽布（hop）、香蛇麻花、酒花、野酒花，為桑科草屬多年生攀緣草本植物[1]，酒花品種很多，分為苦味型和香味型兩種。酒花為貴重的特用經(jīng)濟作物，是釀造啤酒的重要原料。酒花中的主要成分能賦予啤酒柔和優(yōu)美的芳香和爽口的微苦味，能加速麥汁中高分子蛋白的絮凝，提高啤酒泡沫的起泡性和泡持性，也能增加啤酒的生物穩(wěn)定性，是釀造啤酒不可缺少的物質[2-3]。目前，酒花中已檢測出數(shù)百種組成不同的有機化合物，其風味特征是由一組化合物之間既獨立又相互協(xié)同而產(chǎn)生的[4]。而酒花中的揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分對其風味影響較大。

新疆具有啤酒花生長得天獨厚的自然條件，新疆啤酒花種植區(qū)域和種植品種較多，是世界三大啤酒花種植基地之一，種植面積和產(chǎn)量位居全國第一[5]。由于新疆的特殊氣候環(huán)境，新疆產(chǎn)地酒花在品種和質量上也具有明顯的地域特征。

對于酒花及其產(chǎn)品中揮發(fā)性成分的分析，常用的萃取方法有水蒸氣蒸餾法、揮發(fā)油提取器提取法、連續(xù)液-液提取技術[6]、固相微萃取法等[7-9]，由于固相微萃取操作簡單、時間短、樣品量少，適用于揮發(fā)性有機物、半揮發(fā)性有機物及不具揮發(fā)性的有機物，可以隨身攜帶，現(xiàn)場采集，并可在氣相色譜儀器上直接進樣，提高了分析速度和檢測靈敏度[10-11]，采用固相微萃取方法萃取揮發(fā)性組分成為發(fā)展趨勢。因此，研究通過與揮發(fā)油提取器提取法比較，采用頂空-固相微萃取法-氣相色譜-質譜聯(lián)用（headspace solid phase microextraction-gas chromatography mass spectromeyry，HS-SPME-GC-MS）分析新疆產(chǎn)地啤酒花中的揮發(fā)性成分，由于酒花品種不同、產(chǎn)地的差異，揮發(fā)性組分的含量差別較大，因而采用SPSS軟件進行聚類分析，以期為新疆酒花質量的控制提供更好的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆青島大花（苦花，樣品7）、扎一顆粒啤酒花（樣品6）、馬可波羅顆粒啤酒花（樣品5）：新疆綠寶酒花有限公司；樣品1，2，3，4，8為采摘于昌吉、塔城及庫爾勒的啤酒花樣品。

無水硫酸鈉、無水乙醚均為分析純：天津市致遠化學試劑有限公司；Millipore超純水：美國Millipore公司。

1.2 儀器與設備

Finnigan Trace GC-DSQ氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（配置電子電離源）：美國Thermo Fisher公司；BB89-2000揮發(fā)油提取器：北京中西遠大科技有限公司；VIC-412電子分析天平：北京賽多利斯儀器有限公司；SPE-12固相微萃取裝置：美國Superlco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 GC-MS聯(lián)用條件

Finnigan Trace GC-DSQ氣相色譜-質譜聯(lián)用儀；色譜柱：DB-5毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）檢索譜庫：NIST、Replib、Mainlib。

色譜條件：起始柱溫40 ℃保持2 min，以5.5 ℃/min升溫至100 ℃保持1 min，以3.5 ℃/min升至120 ℃保持4 min，以2 ℃/min升至160 ℃保持1 min，再以10 ℃/min升溫至230 ℃保持5 min。載氣為He，流速1.2 mL/min，分流比1∶10，進樣口溫度220 ℃，傳輸線溫度250 ℃。質譜條件：離子源溫度220 ℃，電離方式為電子電離（electron ionization，EI），電子能量70 eV，掃描范圍50～400 amu。

1.3.2 固相微萃取方法

啤酒花樣品，于-20 ℃密封儲藏于冰箱中，使用前取出粉碎。用于提取方法比較的為苦花型青島大花。

采用靜態(tài)頂空固相微萃取法，準確稱取0.15 g樣品，置于4 mL頂空樣品瓶中，于70 ℃恒溫水浴中預熱5 min，吸附30 min。萃取完畢后，進氣相色譜-質譜儀分析，萃取頭在220 ℃解析5 min。

1.3.3 揮發(fā)油提取器提取條件

稱取粉末樣品25 g，加入1 L水，連接揮發(fā)油提取器，提取4 h，直至無油分流出。收集揮發(fā)油成分，加無水硫酸鈉干燥，加乙醚定容至15 mL。

2 結果與分析

2.1 兩種提取方法的比較

以固相微萃取與揮發(fā)油提取器提取樣品進行比較，通過比較發(fā)現(xiàn)揮發(fā)油提取器提取的目標物較少，而固相微萃取可以萃取得到更多的目標物峰。而且由于揮發(fā)油提取需要消耗較大的樣品量，提取效率也不夠高，因此，實驗采用固相微萃取法萃取揮發(fā)性成分。

2.2 SPME萃取條件的選擇

為了確定SPME的最佳萃取條件，分別考察了不同萃取纖維、萃取溫度和萃取時間、萃取樣品量對測定結果的影響。以苦花樣品中的揮發(fā)性組分α-蒎烯、2-十一酮，α-古巴烯，2-十二酮，β-石竹烯，α-石竹烯，γ-依蘭油烯，γ-杜松烯八種物質的峰面積被用來確定最佳萃取條件。

2.2.1 萃取方式的選擇

準確稱取0.1 g樣品，采用100 μm聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）、75 μm CAR/PDMS、65 μm CW/DVB、30 μm PDMS萃取纖維頭，在60 ℃萃取30 min進行比較，由圖1可知，100 μm PDMS纖維對這8種化合物的萃取效果更好，65 μm CW/DVB的萃取效果較好。而75 μm CAR/PDMS由于適合萃取極性物質，很多物質未萃取出來。因此，進一步分析均采用100 μm PDMS纖維萃取。

圖1 不同萃取纖維對峰面積響應值的影響Fig.1 Effect of different fiber on peak area response values

2.2.2 萃取溫度和萃取時間的選擇

萃取溫度和萃取時間是影響萃取速度和效率的重要因素[9]。高溫、長時間有利于HS-SPME萃取，但溫度太高、時間太長又會降低萃取頭的吸附能力。

圖2 不同萃取溫度對峰面積響應值的影響Fig.2 Effect of different extraction temperature on peak area response values

萃取溫度的選擇：準確稱取0.1 g樣品，利用100 μm PDMS纖維，在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃條件下萃取30 min，進行選擇最佳萃取溫度。結果見圖2。由圖2可知，隨著溫度的升高，選取的目標物的響應峰面積普遍增大，在70 ℃的萃取效果較好，溫度過高不利于操作進行。

萃取時間的選擇：準確稱取0.1 g樣品，利用100 μm PDMS纖維，在70 ℃分別萃取5 min、10 min、20 min、25 min、30 min、40 min，結果見圖3。由圖3可知，萃取時間為30 min時，選取的目標物響應都較高。

圖3 不同萃取時間對峰面積響應值的影響Fig.3 Effect of different extraction time on peak area response values

2.2.3 不同樣品量的選擇

不同的樣品量影響萃取頭的萃取體積，對萃取效率的影響非常重要。分別準確稱取0.05 g、0.10 g、0.15 g、0.20 g樣品，在優(yōu)化的萃取條件下進行比較，結果見圖4。由圖4可知，當樣品量為0.15 g時，各選取的目標物響應都較好。

圖4 不同樣品量對峰面積響應值的影響Fig.4 Effect of different sample loading on peak area response values

因此，在優(yōu)化的色譜條件下，選取樣品量為0.15 g，萃取溫度為70 ℃，萃取時間為30 min作為啤酒花樣品揮發(fā)性組分分析的條件。

2.3 固相微萃取-氣質聯(lián)用儀分析結果

在優(yōu)化的氣相色譜-質譜條件下，可以分離出100多種成分，經(jīng)計算機檢索譜庫及人工分析質譜圖，并參閱有關文獻[12-14]能準確鑒定出57種物質。啤酒花油的主要成分為萜烯類化合物，占總酒花油的61.10%，如α-石竹烯、α-蒎烯；其次酯類化合物15種，占總酒花油的15.25%，如丁酸葉醇酯、丙酸葉醇酯、其次為醇類，占揮發(fā)油總量的3.95%；此外，還有少量的酮類、酮酸類、萜烯環(huán)氧化合物等。

2.4 聚類分析與判別分析

圖5為樣品中8種目標物的含量圖。以所測酒花中的8種目標物為變量，分別對8種產(chǎn)地的酒花進行聚類分析，結果見圖6和圖7。其中，樣品5為馬可波羅顆粒酒花，樣品6為扎一顆粒啤酒花，樣品7為青島大花，其他為采摘樣品。對選取的不同啤酒花品種進行聚類分析，聚類分析是根據(jù)試驗數(shù)據(jù)本身所有的定量或定性的特征對大量數(shù)據(jù)進行分組歸類以清楚數(shù)據(jù)集內(nèi)在結構，同時對每一個數(shù)據(jù)集進行描述過程的一種方法[15-16]。

圖5 酒花中8種目標物的含量Fig.5 The content of 8 kinds of compounds in hops

圖6 聚類分析樹狀圖Fig.6 Dendrogram of cluster analysis

由圖5可知，樣品啤酒花中，α-葎草烯含量較高，其次是β-石竹烯，其他主要物質含量相當。由圖6、圖7可知，樣品2與樣品6歸為第1類，樣品7與樣品8歸為第2類，樣品3、4、5、1歸為第3類。三個組中心也就是聚類分析后得到的三種類別。

區(qū)別苦花型酒花與香花型酒花的主要因素是月桂烯（香葉烯）的含量，另一個區(qū)別是葎草烯與石竹烯的比值，香花型酒花的比值較高?？嘈途苹ㄅc香型酒花具有明顯的區(qū)別，各物質的含量有著明顯的差距。因此依據(jù)判斷，樣品7即新疆青島大花為苦花型啤酒花，樣品5馬可波羅顆粒為另一類苦花型啤酒花，樣品6扎一顆粒為香花型啤酒花，與實際符合，且能很好的判定其他幾種采摘酒花的品種和類型，得出樣品2為香型酒花，樣品1、3、4、8為苦型酒花。

圖7 Fisher非標準化典型判別分組圖Fig.7 Fisher typical non-standard discriminant group figure

3 結論

通過與揮發(fā)油提取器提取方法的比較，采用頂空固相微萃取-氣質聯(lián)用技術（HS-SPME-GC-MS）分析新疆產(chǎn)地啤酒花及顆?；ㄖ械膿]發(fā)性成分。獲得固相微萃取的最佳提取條件為：100 μm PDMS萃取纖維、萃取時間30 min，萃取溫度70 ℃，萃取樣品量0.15 g。在最優(yōu)萃取條件下對不同產(chǎn)地、不同品種的酒花進行了聚類分析和判別分析，對不同酒花中揮發(fā)性成分的組成進行了歸類。所得結果可靠，能有效的為啤酒花品種和品質的鑒定提供依據(jù)，有利于對新疆酒花產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展。

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