劉占利 陳岳明 盛文彬 黃先玫 楊一華 馮亞男 黃暉 鄭緒陽

ALOX5基因啟動子SP-1結(jié)合位點多態(tài)性與兒童哮喘的相關(guān)性研究

劉占利 陳岳明 盛文彬 黃先玫 楊一華 馮亞男 黃暉 鄭緒陽

目的 探討ALOX5基因啟動子SP-1結(jié)合位點多態(tài)性和漢族兒童支氣管哮喘發(fā)生的關(guān)聯(lián)。 方法 選取88例支氣管哮喘兒童為病例組，124例健康兒童為對照組。用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）分析ALOX5基因啟動子SP-1結(jié)合位點多態(tài)性，采用實時熒光逆轉(zhuǎn)PCR檢測病例組和對照組ALOX5各基因型兒童外周血ALOX5 mRNA表達(dá)量。 結(jié)果 臨床資料顯示有家族史、非母乳喂養(yǎng)、有過敏史和被動吸煙與兒童支氣管哮喘發(fā)病相關(guān)（P＜0．05），性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。經(jīng)PCR-SSCP鑒定ALOX5有6種基因型，包括4/4、4/5、4/6、5/5、5/6和6/6；ALOX5基因多態(tài)性在漢族兒童中分布符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=0．361，P＞0．05）。等位基因4及基因型（4/4+4/5）在病例組和對照組中分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0．05）。健康兒童ALOX5 mRNA表達(dá)量（0．20±0．14）顯著低于哮喘兒童（0．28±0．15）（P＜0．05）；基因型（4/4+4/5）個體ALOX5 mRNA表達(dá)量高于基因型（5/5+5/6）個體（P＜0．05），其余各基因型組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0．05）。 結(jié)論 ALOX5基因啟動子SP-1結(jié)合位點多態(tài)性可能與漢族兒童支氣管哮喘相關(guān)，該位點調(diào)控ALOX5 mRNA表達(dá)。

支氣管哮喘 ALOX5基因 單核苷酸多態(tài)性

支氣管哮喘是由遺傳和環(huán)境因素引起的下呼吸道慢性炎癥性失調(diào)。半胱胺酰白三烯（cys-LTs）是參與炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，可引起支氣管阻塞、組織水腫、嗜酸粒細(xì)胞遷移和刺激氣道分泌增加。哮喘患者尿液、呼出氣體凝結(jié)物、痰和血清中均顯示cys-LTs水平顯著增高[1-4]。ALOX5基因編碼的花生四烯酸5-脂氧合酶（5-LO）是白三烯（LTs）和脂氧素（LXs）生成旁路的起始催化酶。在炎癥和過敏等疾病中5-LO表達(dá)通常升高，可能最終使cys-LTs類代謝產(chǎn)物增加。ALOX5基因啟動子區(qū)SP-1結(jié)合位點（-GGGCGG-）呈現(xiàn)一個插入/缺失多態(tài)性，野生型基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點（-GGGCGG-）為5個（n=5），而突變型基因則增加1、2或3個鋅指結(jié)構(gòu)或者減少1或2個鋅指結(jié)構(gòu)（non-5），該多態(tài)性可引起5-LO表達(dá)的改變[5-6]，提示ALOX5基因啟動子區(qū)插入/缺失多態(tài)性可能與炎癥和過敏性疾病發(fā)生相關(guān)。

關(guān)于ALOX5基因啟動子區(qū)插入/缺失多態(tài)性與哮喘的關(guān)聯(lián)研究結(jié)果目前不盡相同[7-9]，可能主要由于不同人群基因型分布以及不同地區(qū)環(huán)境因素，研究樣本量大小等因素引起。此外，涉及漢族兒童的研究資料更是少見。

因此，本研究以支氣管哮喘漢族兒童為病例組，以健康漢族兒童為正常對照組，通過檢測兩組間等位基因頻率、基因型分布及不同基因型個體間ALOX5表達(dá)差異，旨在能夠初步闡明ALOX5基因啟動子區(qū)插入/缺失多態(tài)性與漢族兒童支氣管哮喘發(fā)生的關(guān)聯(lián)。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2010-08—2012-10在我院兒科急診、門診及住院的漢族患兒。依據(jù)2008年中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組修訂的兒童哮喘防治常規(guī)[10]確診為支氣管哮喘的急性發(fā)作期兒童患者88例為病例組，年齡6個月～8歲，中位年齡3.2歲；其中男49例，女39例，病程6月～7年，中位數(shù)2.8年；選擇124例健康兒童為對照組，年齡在6個月～8歲，中位年齡3.2歲；其中男67例，女57例，無呼吸道及其它部位感染以及過敏反應(yīng)史。各組均除外并發(fā)有呼吸衰竭、心力衰竭、先天性心臟病等明顯疾病患者；詳細(xì)記錄患者各項臨床資料。所有研究對象均對本研究知情同意，簽署知情同意書并獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 血標(biāo)本收集及基因組DNA提取 采集全部對象清晨空腹靜脈血3ml，EDTA.K3抗凝，置-20℃冷凍備用?；蚪MDNA提取采用全血基因組DNA提取試劑盒（北京TIANGEN BIOTECH），按照說明書進(jìn)行操作，提取的DNA樣本采用紫外分光光度法（260/280比值）確定DNA的純度，OD260測定DNA的濃度。

1.2.2 PCR擴增 ALOX5基因擴增上游引物為5＇-AGGACCAGACACCTCGCTGAGGAGA GAC-3＇，下游引物為5＇-GAGCAGCGAGCGCCGGGAGCCTCGGC-3＇。反應(yīng)體系為15μl，含50ng基因組DNA，10.0pmol每種引物，0.2mM每種單核苷酸，10×PCR緩沖液（50mM KCl，10mM Tris HCl和0.1%Triton X-100，1.5mM MgCl2和1.0U Taq酶）（大連TAKARA）。PCR擴增條件如下：95℃5min，（95℃ 30s，64℃ 30s，72℃ 40s）×40循環(huán)，72℃10min。

1.2.3 ALOX5基因型檢測 采用SSCP方法。配制10.0%丙烯酰胺凝膠，每個樣品用6×上樣緩沖液混合，最終上樣量為20μl，1×TAE為電泳緩沖液，以恒定電壓為60V電泳2.5h。電泳結(jié)束后，膠膜銀氨染色后用凝膠成像儀（美國BioRad）觀察條帶并保存圖像。電泳后可以產(chǎn)生的片段分別為255 bp（12bp缺失）、261bp（6bp缺失）、267bp（野生型）和273bp（6 bp插入），相對應(yīng)于3、4、5和6個SP1結(jié)合位點。針對261 bp、267 bp和273 bp條帶分別回收凝膠，純化DNA后以ALOX5基因PCR擴增引物進(jìn)行雙向測序進(jìn)行基因型確認(rèn)。

1.2.4 ALOX5 mRNA表達(dá)檢測 按照基因分型結(jié)果，在病例組中選擇4/4基因型9例，4/5基因型20例，5/5基因型20例和5/6基因型10例；在對照組中選擇4/4基因型9例，4/5基因型25例，5/5基因型25例和5/6基因型10例。用TRIzol（美國英維捷）提取全血總RNA，按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas，EU）說明書操作合成cDNA。SYBR Green I實時熒光PCR檢測ALOX5 mRNA相對表達(dá)量，PCR擴增引物分別為：上游5＇-ACTGGAAACACGGCAAAAAC-3＇，下游5＇-TCACGGGGTAAATCCTTGTG-3＇；以β-actin基因作為內(nèi)參照，上游5＇-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3＇，下游5＇-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3＇。PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為：95℃3min，（95℃10s，60℃45s）×40循環(huán)，60℃時收集熒光。根據(jù)2-ΔΔCt法來計算ALOX5 mRNA表達(dá)量[11]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以表示，非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)表示。Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗用χ2檢驗。病例組和對照組間性別、年齡以及基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。ALOX5 mRNA表達(dá)量兩組間比較采用t檢驗，3組間比較采用ANOVA檢驗。關(guān)聯(lián)分析用帶有95%可信區(qū)間（CI）的比值比（OR）表示。

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般臨床特點 經(jīng)過對各項資料分析，結(jié)果顯示有家族史、非母乳喂養(yǎng)、有過敏史和被動吸煙與兒童支氣管哮喘發(fā)病相關(guān)（P＜0.05），而在性別、年齡方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。哮喘患兒中有83.0%顯示過敏原陽性，其中吸入性過敏原陽性占絕大多數(shù)（81.4%），詳見表1。

表1 支氣管哮喘患兒和健康兒童一般臨床資料[例（%）]

2.2 ALOX5基因多態(tài)性在支氣管哮喘兒童組和健康兒童組中等位基因及基因型分布 經(jīng)PCR-SSCP鑒定可見6種基因型，包括4/4、4/5、4/6、5/5、5/6和6/6；其中4/4、5/5和6/6條帶經(jīng)膠回收、純化后測序確認(rèn)，結(jié)果完全一致，見圖1。ALOX5基因多態(tài)性在漢族健康兒童和支氣管哮喘兒童中分布情況見表2，該基因等位基因頻率及基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=0.361，P＞0.05）。

由表2可見，等位基因4以及基因型（4/4+4/5）在病例和對照組中分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。2.3 ALOX5 mRNA表達(dá)量 ALOX5 mRNA在各組表達(dá)量見表3。健康兒童ALOX5 mRNA表達(dá)量（0.20±0.14）顯著低于哮喘兒童（0.28±0.15）（F=9.639，P＜0.05）；在病例組和對照組中，基因型（4/4+4/5）個體ALOX5 mRNA表達(dá)量均高于基因型（5/5+5/6）個體（F=4.194、5.178，均P＜0.05），其余各基因型組間比較均無明顯差異（均P＞0.05）。

圖1 ALOX5基因多態(tài)性鑒定 [A.ALOX5基因PCR-SSCP基因型結(jié)果（a：5/6基因型；b：5/5基因型；c：4/5基因型；d：4/4基因型；e：4/6基因型；f：6/6基因型）；B.ALOX5基因4/4基因型測序結(jié)果（對應(yīng)于圖A中條帶d）；C.ALOX5基因5/5基因型測序結(jié)果（對應(yīng)于圖A中條帶b）；D.ALOX5基因6/6基因型測序結(jié)果（對應(yīng)于圖A中條帶f）]

表2 ALOX5基因多態(tài)性在支氣管哮喘兒童組和健康兒童組中分布[例（%）]

3 討論

兒童支氣管哮喘是西方發(fā)達(dá)國家最常見的兒童疾病之一，其在我國兒童人群中發(fā)病率約達(dá)3%，且近些年呈上升趨勢。哮喘是一種復(fù)雜的多基因疾病，同時受遺傳因素和環(huán)境因素的雙重影響。慢性呼吸道炎癥是兒童支氣管哮喘的典型特征之一，而且在哮喘患者血清、尿液和呼出氣體凝結(jié)物中LTs C4、D4和E4水平增高[1-4]。ALOX5是上述產(chǎn)物生物合成途徑中的首個催化酶，其基因啟動子區(qū)SP1結(jié)合位點缺失1個或2個（-GGGCGG-）序列可能減少ALOX5 mRNA表達(dá)[6]。國內(nèi)外大量研究證實，在過敏性哮喘、運動性哮喘、阿司匹林哮喘患者中應(yīng)用ALOX5抑制劑或白三烯受體拮抗劑可明顯緩解哮喘癥狀，提高患者肺功能水平[12-13]。

表3 ALOX5 mRNA表達(dá)量

本研究結(jié)果顯示ALOX5基因在漢族兒童中等位基因、基因型分布與韓國兒童基本相近，在我們的樣本中同樣未發(fā)現(xiàn)3等位基因，東亞黃種人5/5基因型分布低于白種人[8，14]，表明ALOX5基因多態(tài)性在人種間分布差異較大。通過關(guān)聯(lián)分析，我們發(fā)現(xiàn)攜帶等位基因4的漢族兒童發(fā)生支氣管哮喘的風(fēng)險高于攜帶等位基因5個體（OR=1.600，95%CI：1.018～2.519），基因型（4/4+4/5）兒童發(fā)生支氣管哮喘的風(fēng)險高于基因型5/5個體（OR= 1.903，95%CI：0.989～3.674）。在韓國學(xué)者的研究中，攜帶突變型（non-5）的阿司匹林不耐受哮喘（AIA）患者比野生型具有更嚴(yán)重的氣道高反應(yīng)性，但并未顯示突變型是AIA的危險因素。Galván等[14]研究了西班牙人群中ALOX5基因啟動子SP-1結(jié)合位點多態(tài)性與哮喘的關(guān)聯(lián)，結(jié)果提示該位點與哮喘發(fā)生無關(guān)聯(lián)。造成以上這些矛盾結(jié)果，可能與人種、研究方案或樣本大小等因素有關(guān)。

本研究還分析了病例組、對照組以及不同基因型個體間全血ALOX5表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康兒童ALOX5 mRNA表達(dá)顯著低于哮喘兒童（P＜0.05）；無論是病例組還是對照組，基因型（4/4+4/5）個體表達(dá)ALOX5均高于基因型（5/5+5/6）個體（P＜0.05）。該結(jié)果表明ALOX5高表達(dá)與漢族兒童哮喘可能相關(guān)，同時提示ALOX5基因啟動子SP-1結(jié)合位點可能是一個能影響其表達(dá)的功能性位點。Vikman等[15]的研究也表明，在淋巴細(xì)胞中3、4等位基因與ALOX5基因高表達(dá)相關(guān)，通過分析ALOX5基因啟動子及第一內(nèi)含子區(qū)域4個CpG島甲基化情況，發(fā)現(xiàn)差異性甲基化的CpG島位于ALOX5基因啟動子SP1結(jié)合位點內(nèi)，進(jìn)而調(diào)控ALOX5基因表達(dá)。

因此，本研究提示ALOX5基因啟動子SP-1結(jié)合位點多態(tài)性可能與漢族兒童支氣管哮喘相關(guān)，該位點能調(diào)控ALOX5 mRNA表達(dá)。

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Polymorphism of SP-1 binding motif in ALOX5 promoter may be associated with bronchial asthma susceptibility in Chinese Han children

Objective To investigate the association between polymorphism of SP-1 binding motif in ALOX5 promoter and bronchial asthma susceptibility in Chinese Han children． Methods Eighty-nine children with bronchial asthma(case group)and 124 healthy children (control group)were enrolled in the study．Polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism(PCR-SSCP)were applied to detect the polymorphism of ALOX5．Expression ALOX5 mRNA in peripheral blood was analyzed by real-time PCR in different genotypes of case and control groups． Results Clinical data revealed that family history,non-breastfeeding,history of allergies and passive smoking were the risk factors for bronchial asthma in Han children(P＜0．05)．Six genotypes of ALOX5 were identified by PCR-SSCP,including 4/4,4/5,4/6,5/5,5/6 and 6/6 genotypes．ALOX5 polymorphism in Han children was fitted with Hardy-Weinberg balance(χ2=0．361,P＞0．05)．The distributions of Allele 4 and genotypes(4/4+4/5)in the case and control groups showed significant differences(P＜0．05)．Relative expression levels of ALOX5 mRNA in healthy children(0．20±0．14)was significantly lower than that in asthmatic children(0．28±0．15)(P＜0．05)．The expression level of ALOX5 mRNA in genotypes(4/4+4/5)individuals was higher than those in genotypes(5/5+5/6)(P＜0．05)． Conclusion The polymorphism of SP-1 binding motif in ALOX5 promoter may be associated with the occurrence of bronchial asthma in Chinese Han children,which modulates ALOX5 mRNA expression．

Bronchial asthma ALOX5 gene Single nucleotide polymorphism

2014-05-22）

（本文編輯：田云鵬）

杭州市科技發(fā)展計劃項目（20110833B06）

310006 杭州市第一人民醫(yī)院兒科（劉占利、盛文彬、黃先玫、楊一華、馮亞男、黃暉、鄭緒陽），基因室（陳岳明）

盛文彬，E-mail：swb8825@163.com