王曉娟，米榮升，周 鵬，黃 燕，王向佩，楊曉嬌，石 凱，劉宇軒，雷曉思，陳兆國，趙 權(quán)

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，長春 130118；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室 中國農(nóng)業(yè)科學院動物源性食品安全研究中心，上海 200241）

四種隱孢子蟲半胱氨酸蛋白酶Cryptopain-1基因的克隆和序列分析

王曉娟1,2，米榮升2，周 鵬2，黃 燕2，王向佩1,2，楊曉嬌2，石 凱2，劉宇軒2，雷曉思2，陳兆國2，趙 權(quán)1

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，長春 130118；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室 中國農(nóng)業(yè)科學院動物源性食品安全研究中心，上海 200241）

為克隆不同種隱孢子蟲（Cryptosporidium spp.）的半胱氨酸蛋白酶Cryptopain-1基因，分析其核苷酸與編碼氨基酸序列的變異情況，根據(jù)GenBank上公布的微小隱孢子蟲（C. parvum）Cryptopain-1基因序列設計合成引物，用PCR技術(shù)從不同種隱孢子蟲基因組DNA中擴增Cryptopain-1基因，并將其克隆至pZeroBack/blunt載體，陽性克隆經(jīng)PCR鑒定正確后測序，與微小隱孢子蟲Cryptopain-1基因進行序列同源性比對，并進行系統(tǒng)進化分析。結(jié)果顯示，本研究成功從泰澤隱孢子蟲（C. tyzzeri）、火雞隱孢子蟲（C. meleagridis）、兔隱孢子蟲（C. cuniculus）基因組DNA中擴增出Cryptopain-1基因。與微小隱孢子蟲Cryptopain-1基因比較，泰澤隱孢子蟲、火雞隱孢子蟲、兔隱孢子蟲Cryptopain-1基因核苷酸序列相似性分別為98.67%、94.53%、98.34%，演繹的氨基酸序列相似性分別為99.00%、96.51%、99.00%。研究結(jié)果為利用Cryptopain-1基因進行隱孢子蟲的代謝、致病機理等研究奠定了基礎。

隱孢子蟲；Cryptopain-1基因；克?。恍蛄蟹治?/p>

隱孢子蟲（Cryptosporidiumspp.）是一種細胞內(nèi)寄生原蟲，它能夠感染多種動物和人，引起以腹瀉為主要癥狀的隱孢子蟲?。╟ryptosporidiosis）[1]。隱孢子蟲病不僅給畜牧業(yè)帶來了很大的經(jīng)濟損失，而且對人類健康也有嚴重威脅。健康人感染隱孢子蟲通常表現(xiàn)為自限性腹瀉，但是免疫功能不全的人尤其是艾滋?。ˋIDS）患者感染隱孢子蟲會引起長期、嚴重的腹瀉，甚至死亡[2]。盡管近年來隱孢子蟲分子生物學研究取得重要進展，但是目前仍然沒有一種有效的疫苗或者治療方法[3]。因此，對隱孢子蟲生活史中發(fā)揮重要生理功能的靶分子的鑒定就顯得尤為重要。

半胱氨酸蛋白酶（cysteine protease，CP）是一類在酶的活性中心含有半胱氨酸殘基的蛋白水解酶，生物體內(nèi)的很多化學反應都需要其催化，它參與生物體多種生理病理過程，備受學者的關注[4]。對人CP的研究主要集中在細胞凋亡和惡性腫瘤兩方面，而對于寄生蟲CP，主要是研究其在寄生蟲免疫逃避、毒力、蟲體入侵、脫囊/包囊形成等過程中的作用[5-7]。對頂復門寄生蟲CP的研究發(fā)現(xiàn)，該酶在瘧原蟲（Plasmodiumspp.）[8,9]、弓形蟲（Toxoplasma gondii）[10-13]、艾美耳球蟲（Eimeriaspp.）[14]生活史中有至關重要的作用，包括蛋白加工、宿主細胞入侵、脫囊和營養(yǎng)吸收，但是對隱孢子蟲CP的研究甚少。1999年，Petersen和Huang在GenBank上登錄了微小隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum）NINC株CP及其前體序列（登錄號：AF091366）；2004年，Abrahamsen等[15]通過對微小隱孢子蟲Iowa Ⅱ分離株的全基因組序列進行測定，報道了微小隱孢子蟲CP基因序列（GenBank登錄號：XM_627814）；2009年，Na等[16]設計引物，以微小隱孢子蟲DNA為模板成功擴增了該基因，將其標記為Cryptopain-1基因，并進行了克隆表達，采用免疫熒光技術(shù)對其在微小隱孢子蟲子孢子上的定位進行了分析，發(fā)現(xiàn)Cryptopain-1在微小隱孢子蟲子孢子階段表達，能水解纖維連接蛋白和膠原蛋白，而這些蛋白是宿主細胞外基質(zhì)和維持細胞完整性的重要成分，從而推測它在隱孢子蟲入侵和逸出宿主細胞時可能發(fā)揮重要的生物學作用。由于隱孢子蟲子孢子對宿主細胞的附著和侵襲是其致病的關鍵，因此，隱孢子蟲CP Cryptopain-1基因有可能成為隱孢子蟲病藥物治療的一種新的靶基因。鑒于此，本研究對不同種隱孢子蟲CP Cryptopain-1基因進行克隆，對其序列進行比較和系統(tǒng)進化分析，為隱孢子蟲代謝、致病及防控研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲種和菌株微小隱孢子蟲Iowa Ⅱ分離株和泰澤隱孢子蟲（C. tyzzeri）由中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所隱孢子蟲病防治課題組保存提供，并分別經(jīng)新生犢牛和ICR小鼠傳代保種；火雞隱孢子蟲（C. meleagridis）由中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所黃兵研究員惠贈；兔隱孢子蟲（C. cuniculus）分離自上海某實驗動物飼養(yǎng)場；大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans1-T1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。所有種隱孢子蟲卵囊經(jīng)純化后提取基因組DNA，－20℃保存，并經(jīng)小亞基核糖體RNA（small subunit rRNA,SSU rRNA）基因序列測定和基于該基因的PCRRFLP技術(shù)[17,18]鑒定種類。

1.2 主要試劑KOD DNA聚合酶購自TOYOBO公司；pZeroBack/blunt載體購自天根生化科技（北京）有限公司；T4 DNA 連接酶、DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；AxyPrep DNA膠回收試劑盒購自美國康寧公司。

1.3 引物的設計和合成根據(jù)GenBank公布的微小隱孢子蟲Cryptopain-1基因序列（登錄號：DQ156545），利用Primer Premier 5.0軟件設計1對引物，P1：5'-ATGGACATAGGAAACAACGTGGAA GAACAT-3'；P2：5'-TTATATTGATTGATTAATC ACTGGATACAC-3'。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.4 Cryptopain-1基因的PCR擴增按常規(guī)方法進行PCR擴增，在50 μL的反應體系中，加入2×PCRbuffer （含Mg2+） 25 μL，100 μmol/L引物P1、P2各 0.5 μL，2 mmol/L dNTP 8 μL，20 mg/mL BSA 2 μL，1 U/μL KOD酶1 μL，DNA模板2 μL，加滅菌水補至50 μL。反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min 30 s，共35個循環(huán)；最后在72℃延伸10 min。取5 μL擴增產(chǎn)物進行12 g/L瓊脂凝膠電泳鑒定，用凝膠成像儀Image Quant 300（美國GE公司）觀察和記錄結(jié)果。

1.5 目的基因的克隆與鑒定將目的片段進行切膠回收，克隆到pZeroBack/blunt載體中，轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細胞，挑取單克隆培養(yǎng)，菌液鑒定正確的陽性克隆挑取2個送北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。四次測序結(jié)果完全一致后確定為該基因序列。

1.6 Cryptopain-1基因序列分析用DNAMAN 7.0軟件將獲得的不同種隱孢子蟲Cryptopain-1基因核苷酸序列及其推導的氨基酸序列與 GenBank 登錄的微小隱孢子蟲序列 （登錄號：DQ156545） 進行同源性比較。

1.7 不同種間半胱氨酸蛋白酶基因的進化樹分析從GenBank下載微小隱孢子蟲（登錄號：DQ156545）、人隱孢子蟲（C. hominis，登錄號：XM_661605）、鼠隱孢子蟲（C. muris，登錄號：XM_002142683）、柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella，登錄號：JN641867）、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii，登錄號：AY660746）、克氏錐蟲（Trypanosoma cruzi，登錄號：M90067）、帕氏利什曼原蟲（Leishmania pifanoi，登錄號：M97695）、惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparumfalcipain-2，登錄號：AF239801；Plasmodium falciparumfalcipain-3，登錄號：AF282974）、間日瘧原蟲（Plasmodium vivaxvivapain-2，登錄號：AY208270；Plasmodium vivaxvivapain-3，登錄號：AY221736）、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus，登錄號：M80388）、日本血吸蟲（Schistosoma japonicum，登錄號：U38475）、華支睪吸蟲（Clonorchis sinensis，登錄號：AB020036）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，登錄號：M97910）、鯉魚（Cyprinuscarpio，登錄號：L30111）、小家鼠（Mus musculus，登錄號：J02583）、人（Homo sapiens，登錄號：M20496）18個物種的CP基因序列，用軟件MEGA 5.1以鄰接法分析隱孢子蟲CP Cryptopain-1基因與其他物種CP基因之間的親緣關系。

2 結(jié)果

2.1 Cryptopain-1基因的PCR擴增經(jīng)過35個循環(huán)的PCR擴增，成功地從微小隱孢子蟲Iowa Ⅱ分離株、泰澤隱孢子蟲、兔隱孢子蟲和火雞隱孢子蟲卵囊基因組DNA中擴增到Cryptopain-1基因，大小均約為1200 bp（圖1）。

圖1 Cryptopain-1基因PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of PCR products of Cryptopain-1 gene of different Cryptosporidium species

2.2 Cryptopain-1基因核苷酸序列分析經(jīng) DNAMAN 7.0軟件分析表明，4種隱孢子蟲Cryptopain-1基因大小均為1206 bp，編碼401個氨基酸?？寺〉奈⑿‰[孢子蟲Iowa Ⅱ分離株Cryptopain-1基因與GenBank上登錄的微小隱孢子蟲Cryptopain-1基因序列（登錄號：DQ156545）比較，相似性為100%；而泰澤隱孢子蟲、兔隱孢子蟲、火雞隱孢子蟲與其比較，相似性分別為98.67%、98.34%、94.53%（表1），分別有16、20、66個核苷酸差異（圖2）。上述3種隱孢子蟲的Cryptopain-1基因序列均已提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，其中泰澤隱孢子蟲的登錄號為KJ534570、兔隱孢子蟲登錄號為KJ534571、火雞隱孢子蟲登錄號為KJ534572。

圖2 4種隱孢子蟲Cryptopain-1基因核苷酸序列比較Fig.2 Comparison of the nucleotide sequences of Cryptopain-1 gene of four Cryptosporidium species

2.3 Cryptopain-1基因編碼的氨基酸序列分析 用DNAMAN 7.0軟件將測得的Cryptopain-1基因與已知的微小隱孢子蟲相應基因序列翻譯成氨基酸序列并進行同源性比較，結(jié)果泰澤隱孢子蟲、兔隱孢子蟲、火雞隱孢子蟲分別有4、4、14個氨基酸差異（圖3）。與微小隱孢子蟲Cryptopain-1比較，泰澤隱孢子蟲、兔隱孢子蟲相似性均為99.00%，火雞隱孢子蟲相似性為96.51%（表1）。

表1 4種隱孢子蟲Cryptopain-1基因核苷酸和演繹的氨基酸序列相似性比較Table 1 Comparision of Cryptopain-1 gene nucleotide and deduced amino acid sequences between four Cryptosporidium species

圖3 4種隱孢子蟲Cryptopain-1氨基酸序列比較Fig.3 Comparison of the deduced amino acid sequences of four Cryptosporidium species Cryptopain-1

2.4 不同物種間半胱氨酸蛋白酶基因的進化分析 結(jié)果顯示，泰澤隱孢子蟲、兔隱孢子蟲、火雞隱孢子蟲和微小隱孢子蟲、人隱孢子蟲Cryptopain-1基因在一個聚簇上，親緣關系最近；其次是惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲，再次是剛地弓形蟲和利什曼原蟲，最遠的是吸蟲和克氏錐蟲（圖4）。

圖4 不同物種間Cryptopain-1基因的系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Cryptopain-1 gene of different species

3 討論

CP廣泛存在于人、動物和寄生蟲體內(nèi)[6]，它作為一種蛋白水解酶，參與機體蛋白水解。研究發(fā)現(xiàn)，CP在寄生蟲體內(nèi)發(fā)揮著重要生物學功能，包括原蟲、蠕蟲和節(jié)肢動物降解外源性蛋白質(zhì)[19]及脫包囊/包囊形成、脫鞘和羽化[20,21]等。CP不僅與寄生蟲的免疫逃避有關，而且涉及宿主細胞的免疫損傷[9]。因此，它在寄生蟲的生存、發(fā)育及寄生蟲與宿主的相互作用中扮演著十分重要的角色，是在各種寄生蟲感染過程中起重要作用的一類關鍵酶，也越來越受到人們的關注。在其他頂復門寄生蟲如瘧原蟲、弓形蟲和球蟲生命活動中，CP在感染過程中所起的關鍵作用也已被廣泛報道，包括蛋白加工、宿主細胞入侵、脫囊和營養(yǎng)吸收[10-16]。

Cryptopain-1基因是目前微小隱孢子蟲中報道的唯一一種CP基因。分析同一基因在不同種隱孢子蟲間的基因突變對于研究其生物學特性具有重要意義。目前公認的隱孢子蟲有20多種[22]，它們在宿主特異性和致病性方面存在差異。研究表明，雖然不同種隱孢子蟲之間一些已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的蛋白核苷酸序列高度保守，但是仍然存在差異。米榮升等[23]對不同動物來源的鼠源、兔源和豬源隱孢子蟲子孢子表面抗原CP15基因進行擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因同源性為99.23%、97.56%和98.72%。胡義彬等[24]對隱孢子蟲鼠基因型、兔基因型和豬基因型的P23基因進行擴增，同源性為97.3%、97.3%和96.4%。本研究成功克隆了微小隱孢子蟲、泰澤隱孢子蟲、兔隱孢子蟲和火雞隱孢子蟲的Cryptopain-1基因，得到的微小隱孢子蟲基因序列與GenBank登錄的序列完全一致，而泰澤隱孢子蟲、兔隱孢子蟲、火雞隱孢子蟲與微小隱孢子蟲Cryptopain-1基因的相似性分別為98.67%、98.34%、94.53%，分別有16、20、66個核苷酸差異；對演繹的氨基酸序列進行比較，發(fā)現(xiàn)泰澤隱孢子蟲、兔隱孢子蟲均有4個氨基酸差異，相似性為99.00%，而火雞隱孢子蟲有14個氨基酸差異，相似性為96.51%。這種差異可能是由隱孢子蟲種間基因多態(tài)性造成，也可能是發(fā)生了基因突變，需要進一步研究。不同物種間的CP進化親緣關系分析顯示，瘧原蟲與隱孢子蟲親緣關系最近，其次是利什曼原蟲和剛地弓形蟲，而同屬于頂復門寄生蟲的柔嫩艾美耳球蟲與隱孢子蟲親緣關系較遠，這可能是因為CP是一個家族，而GenBank登錄的不同物種的CP與隱孢子蟲Cryptopain-1都屬于該家族但并非同一種蛋白，從而導致他們之間的進化親緣關系比較復雜。但是從進化親緣關系分析中仍然可以看出，不同種隱孢子蟲Cryptopain-1基因序列高度同源，提示該基因表達產(chǎn)物可能成為一個重要的疫苗候選抗原。

對不同種隱孢子蟲CP Cryptopain-1基因的克隆、序列分析和系統(tǒng)進化分析，為利用該基因進行隱孢子蟲的代謝、致病機理等研究提供了科研基礎；能否通過利用Cryptopain-1的酶抑制劑達到抑制隱孢子蟲在體內(nèi)生存繁殖的目的，從而達到防治隱孢子蟲病的作用，尚需進一步研究。

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CLONING AND SEQUENCE ANALYSIS OF CYSTEINE PROTEASE CRYPTOPAIN-1 GENE OF FOUR CRYPTOSPORIDIUM SPECIES

WANG Xiao-juan1,2,MI Rong-sheng2,ZHOU Peng2,HUANG Yan2,WANG Xiang-pei1,2,YANG Xiao-jiao2,SHI Kai2,LIU Yu-xuan2,LEI Xiao-si2,CHEN Zhao-guo2,ZHAO Quan1
(1. College of Animal Science and Technology,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China; 2. Animal-borne Food Safety Research Center of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Key Laboratory of Animal Parasitology of the Ministry of Agriculture,Shanghai Veterinary Research Institute,CAAS,Shanghai 200241,China)

In order to clone Cryptopain-1 gene of different Cryptosporidium species for analysis of genetic variation,a pair of specifi c primers were designed based on the sequence of C. parvum Cryptopain-1 gene published on GenBank. The Cryptopain-1 genes of different Cryptosporidium species were amplified from their genomes using PCR technique and then cloned into pZeroBack/blunt vectors. The cloned genes from the positive recombinant plasmids were sequenced and phylogenetically analyzed. Cryptopain-1 gene of C. parvum shared nucleotide identities at 98.67%,94.53% and 98.34% with C. tyzzeri,C. meleagridis and C. cuniculus. The informationobtained from the present study will be useful for research on metabolism,pathogenecity of Cryptosporieium.

Cryptosporidium; cryptopain-1 gene; cloning; sequence analysis

S852.723

A

1674-6422（2014）05-0041-08

2014-03-07

國家科技重大專項項目（2012ZX10004220）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金項目（2013JB13）；家畜疫病病原生物學國家重點實驗室開放基金課題（SKLVEB2013KFKT017）；上海市科技興農(nóng)重點攻關項目（滬農(nóng)科攻字[2005] 第3-4 號）

王曉娟，女，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

陳兆國，E-mail：zhaoguochen@shvri.ac.c