徐娟 常雁紅 羅暉

摘要

過氧化氫酶作為一種抗氧化劑廣泛存在于各類生物體中，也被應(yīng)用于紡織廢水、食品、工業(yè)酶催化等多個領(lǐng)域。在工業(yè)應(yīng)用中，為了提高過氧化氫酶的催化效率、穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性，通常會對其進(jìn)行固定化。該研究論述了過氧化氫酶的結(jié)構(gòu)、特點、純化方式、固定化和應(yīng)用方面的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞 過氧化氫酶;固定化;應(yīng)用

中圖分類號 S182 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A ?文章編號 0517-6611（2014）34-12035-04

The Progress of Catalase and Its Immobilization with Application

XU Juan， CHANG Yanhong*， LUO Hui

（University of Science and Technology Beijing， Beijing 100083）

Abstract As one kind of antioxidant， catalase can be found in almost all organisms and has been used in various fields， such as textile wastewater， food and enzyme catalysis industries. In order to increase the catalytic efficiency， stability， usability in reactors for industrial application， the catalase often was immobilized. The structure， sources， purification methods， immobilization and application of catalase were discussed.

Key words ?Catalase; Immobilization; Application

過氧化氫酶（CAT， 1.11.1.6）廣泛存在于古生菌、細(xì)菌、真菌、植物和動物體中。它作為一種抗氧化酶起著非常重要的作用，可以高效地將H2O2催化成水和氧氣這2種無害的物質(zhì)，具有清除生物體內(nèi)自由基、保護(hù)細(xì)胞免受損害等作用。同時，過氧化氫酶還能對血紅蛋白及其他含巰基蛋白質(zhì)起到保護(hù)作用，使它們不被氧化[1]。由于該酶具有高效催化性能，它也被廣泛應(yīng)用于酶催化體系、生物傳感器、紡織和食品領(lǐng)域。

1 過氧化氫酶的來源

過氧化氫酶的研究可以追溯到100多年前。最初Thenard發(fā)現(xiàn)了動植物組織可以分解過氧化氫，產(chǎn)生氧氣。1892年Jacobson證明了過氧化氫酶的存在。后來經(jīng)過人們的不斷努力，不僅考察其化學(xué)活性，而且對其活性中心、活性基團(tuán)進(jìn)行深入的研究，并從牛肝中分離得到過氧化氫酶的結(jié)晶[2]。1948年Herbert和Pinsent[3]第一次從藤黃微球菌中獲得原核過氧化氫酶。隨著研究的深入，人們獲取了真核生物所產(chǎn)過氧化氫酶，到后來也可以從酵母中獲取過氧化氫酶[4-6]。目前，研究者們已篩選出越來越多產(chǎn)過氧化氫酶菌株。1951年，Brizuela等[7]首次報道了用桿菌Bacillus發(fā)酵生產(chǎn)過氧化氫酶。隨后，Petruccioli等[8]在1994年通過研究發(fā)現(xiàn)變幻青霉生產(chǎn)過氧化氫酶的強(qiáng)度達(dá)0.1 U/（ml·h）。2004年篩選出的溶壁微球菌所產(chǎn)過氧化氫酶酶活可達(dá)到1 100 U/ml[9]。到2008年，Nakayama等[10]從枯草桿菌中獲得的過氧化氫酶產(chǎn)量達(dá)18 000 U/ml，生產(chǎn)強(qiáng)度已高達(dá)1 000 U/（ml·h）。

隨著菌種篩選工作的不斷展開，人們對于產(chǎn)酶水平的要求也不斷提高，但是通過篩選和培養(yǎng)難以獲得大量且低成本的過氧化氫酶，因此采用基因工程菌來獲取高產(chǎn)量且能滿足不同應(yīng)用條件的過氧化氫酶成為研究熱點。

Furuta等[11]在1990年首次報道了以大腸桿菌為宿主構(gòu)建產(chǎn)過氧化氫酶的基因工程菌，基因來源是小鼠肝臟細(xì)胞，但獲得的產(chǎn)量不高，僅為總可溶蛋白的0.1%。為了獲取產(chǎn)酶量高的過氧化氫酶重組菌，人們開始嘗試不同來源的過氧化氫酶基因和不同表達(dá)宿主。1997年Nagy等[12]將結(jié)核分枝桿菌中的過氧化氫酶基因克隆并導(dǎo)入大腸桿菌，所得過氧化氫酶蛋白量為總蛋白量的30%。2008年又有研究者將嗜冷桿菌中的過氧化氫酶基因克隆導(dǎo)入到大腸桿菌中，重組菌酶活可到達(dá)11 000 U/ml，產(chǎn)率為458 U/（ml·h）[13]。張興群等[14]發(fā)現(xiàn)，來源于微球菌的過氧化氫酶（CAT）比活高，因此將含微球菌過氧化氫酶基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pProExHTCAT導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）中，構(gòu)建工程菌BL21（DE3）/pProExHTCAT，并且優(yōu)化其培養(yǎng)條件，在相同實驗條件下以野生菌酶為對照，重組酶活性提高了66%。

2 過氧化氫酶的結(jié)構(gòu)

現(xiàn)今已有超過300種過氧化氫酶的序列被發(fā)現(xiàn)和報道。根據(jù)酶學(xué)性質(zhì)的不同，可將過氧化氫酶分為單功能過氧化氫酶、雙功能過氧化氫酶、非血紅素過氧化氫酶和微量過氧化氫酶。其中，單功能過氧化氫酶種類最多，分布最廣，活性最高，幾乎分布在所有動植物和微生物體內(nèi)。它由4個具有相同多肽鏈的亞基組成，且每個亞基含有一個血紅素輔基作為活性位點，相對分子量為200～340 kDa。負(fù)責(zé)酶催化活性的血紅素基團(tuán)則位于β位點和幾個螺旋內(nèi)壁之間[15-17]。

雙功能過氧化氫酶主要存在于好氧菌中，其分子量范圍為120～340 kDa[18]。雖然在動物和植物中未發(fā)現(xiàn)該類酶，但其與動植物體內(nèi)的過氧化物酶極其相似，而它的過氧化物活性也表現(xiàn)出血紅素酶的特點[19]。

第三類非血紅素過氧化氫酶，通常也被稱為錳過氧化氫酶。這類過氧化氫酶的分子量為170～210 kDa。通過對植物乳桿菌中錳過氧化氫酶的研究，發(fā)現(xiàn)它包含約30 kDa的幾個亞基，而每個亞基上有一個雙核錳橋聯(lián)中心被四螺旋區(qū)域包裹著[20]。這種高度保守的組成是錳過氧化氫酶序列的典型特征。

第四類微量過氧化氫酶含有少量的血紅素，可能因為血紅素的含量少，其酶的催化活性較低。微量過氧化氫酶包含單功能酶，如氯過氧化物酶、溴過氧化物酶、過氧化氫酶–酚氧化酶等[21-22]。它們的結(jié)構(gòu)和活性位點不同于其他過氧化氫酶和過氧化物酶。主要的差別是在血紅素附近存在半胱氨酸，而不是組氨酸或色氨酸。這個半胱氨酸可以作為作用于血紅素的5個配體之一。另一個重要區(qū)別是，在血紅素的遠(yuǎn)端一側(cè)有一個谷氨酸。它可作為單一的催化殘基，而在其他過氧化氫酶中，催化的殘基是與天冬氨酸或精氨酸組合作用的組氨酸[23]。

而其他交聯(lián)劑如異氰酸衍生物、雙偶氮二聯(lián)苯胺、N，N乙烯馬來酰亞胺、鄰苯二酚衍生物等也被研究者使用。研究者將二氧化鈦微粒用鄰苯二酚衍生物進(jìn)行螯合修飾，然后將其與過氧化氫酶進(jìn)行共價交聯(lián)，所得固定化酶的穩(wěn)定性顯著增加，對其進(jìn)行10次循環(huán)利用后相對酶活仍為90%[41]。

也有研究者將上述方法結(jié)合起來，例如將物理吸附和共價交聯(lián)結(jié)合使用的，其方法是先利用大孔吸附樹脂作為載體對過氧化氫酶進(jìn)行物理吸附，然后加入戊二醛進(jìn)行共價交聯(lián)，得到的固定化過氧化氫酶酶活吸附率為45.2%，其熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性有了一定的提高，重復(fù)利用10次后仍能保持初始酶活的60%以上，具有良好的操作穩(wěn)定性[42]。

通常，固定化條件都是非常溫和的，如20 ℃，pH 7.0[43]。而基于極端過氧化氫酶的研究，可以利用過氧化氫酶自身對高溫或者強(qiáng)堿的耐受性對其進(jìn)行固定化，得到穩(wěn)定性更好、更適于工業(yè)應(yīng)用的固定化酶。本課題組對耐熱過氧化氫酶進(jìn)行55 ℃高溫固定化，在1.5 h后就達(dá)到了最優(yōu)酶活，且熱穩(wěn)定性和耐堿性均較好，得到了制備時間短且性能優(yōu)良的固定化酶。

6 固定化過氧化氫酶的應(yīng)用

6.1 紡織印染工藝

在紡織工藝中往往利用過氧化氫在高溫和強(qiáng)堿的條件下對織物進(jìn)行漂白，為后續(xù)的染色工藝做準(zhǔn)備。漂白后進(jìn)入染色步驟，染浴中如果仍存在未充分分解的過氧化氫，那么會造成漂白后對氧化劑敏感的活性染料褪色，導(dǎo)致染色效果不理想。所以，為了保證后續(xù)的染色工藝順利進(jìn)行，需要將漂白后殘留的過氧化氫全部去除。傳統(tǒng)工藝常采用水洗或者化學(xué)還原劑去除。這不僅使得工藝程序復(fù)雜化，而且容易生成有毒和難降解的物質(zhì)。因此，現(xiàn)今人們多采用過氧化氫酶去除殘留的過氧化氫，即可達(dá)到高效、節(jié)能、環(huán)保的優(yōu)勢。為了提高過氧化氫酶在印染生產(chǎn)中的穩(wěn)定性，研究者們往往對其進(jìn)行固定化。Opwis等[44-45]以棉織物為載體制備固定化過氧化氫酶，使其耐酸堿性、熱穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性顯著提高。而Costa等[46-47]利用無機(jī)材質(zhì)氧化鋁經(jīng)過戊二醛交聯(lián)固定化過氧化氫酶，以此處理氧漂廢水，并且回收用于染色加工。

6.2 食品

現(xiàn)今過氧化氫被應(yīng)用于奶酪、牛奶、雞蛋和乳清等食品的殺菌，同時人們也開始利用過氧化氫酶去除食品中殘留的過氧化氫。這一方法相較于物理或者化學(xué)法而言，能夠節(jié)約成本且達(dá)到環(huán)保、高效的目的。為了減少過氧化氫對奶制品質(zhì)量造成的不利影響，可將食品在65 ℃以下短暫暴露于過氧化氫中，后續(xù)加入過氧化氫酶進(jìn)行處理。在保存牛奶的過程中，過氧化氫酶還可作為乳過氧化物酶和過氧化氫-硫氰酸鹽體系中的成分，在較低濃度過氧化氫的存在下，提高牛奶的抗菌能力。Leman[48]將過氧化氫酶固定在DEAE纖維素上，并用己二胺和戊二醛對其進(jìn)行修飾，將100 mg制備的固定化過氧化氫酶鋪設(shè)在流式反應(yīng)床上，可以處理57 L過氧化氫濃度為0.036%的高溫牛奶。該方法處理效果良好，達(dá)到了牛奶飲用標(biāo)準(zhǔn)。

6.3 酶生物傳感器

在生物傳感器領(lǐng)域研究最早、應(yīng)用最多的為酶電極。這主要是酶電極具有設(shè)備簡單、成本低廉、靈敏度高等特點。過氧化氫酶是酶電極中最常用酶制劑之一。將過氧化氫酶固定在電極表面，在電子受體過氧化氫的作用下，被氧化的反應(yīng)物在電極上電化學(xué)還原，其還原電流與反應(yīng)物的濃度呈正比。此外，過氧化氫酶作為一種血紅素蛋白，直接電化學(xué)也為研究酶電極的氧化還原轉(zhuǎn)換機(jī)制提供了一個模型。Di等[49]

將過氧化氫酶通過二氧化硅溶膠凝膠膜固定在電極表面，固定化酶后酶電極表現(xiàn)出對過氧化氫良好的檢測性能。

6.4 工業(yè)酶催化體系

在很多工業(yè)酶催化過程中會產(chǎn)生過氧化氫，而過氧化氫的存在往往會影響酶催化過程的順利進(jìn)行，所以需要加入過氧化氫酶將產(chǎn)生的過氧化氫分解。例如，葡萄糖氧化酶作為一種糖蛋白能夠氧化βD葡萄糖，并生成葡萄糖酸和過氧化氫，而大量的過氧化氫會抑制葡萄糖氧化酶的活性，從而影響反應(yīng)的順利進(jìn)行。如果在體系中加入過氧化氫酶，則可將過氧化氫分解，保障反應(yīng)的連續(xù)、順利進(jìn)行。崔鳳霞等[50]將葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶進(jìn)行分次固定，并且對固定化條件進(jìn)行了優(yōu)化。該驗結(jié)果說明，所制備的固定化酶具有良好的操作穩(wěn)定性，連續(xù)反應(yīng)10批后相對酶活仍為85.3%。

7 ?結(jié)語

由于過氧化氫酶來源廣泛且催化性能較高，相關(guān)的研究和應(yīng)用一直是人們關(guān)注的熱點。現(xiàn)今過氧化氫酶的固定化和應(yīng)用已取得很大進(jìn)展，相比較游離過氧化氫酶而言，固定化酶能被更加有效地被利用到各個領(lǐng)域中。因此，今后過氧化氫酶的研究工作應(yīng)該側(cè)重于改進(jìn)傳統(tǒng)固定化方法，開發(fā)更多環(huán)保、節(jié)約、有效的固定化方法;利用極端過氧化氫酶的特點，進(jìn)行極端條件下的固定化，制備出性能更加優(yōu)良的固定化酶。由此可見，隨著現(xiàn)代技術(shù)的不斷發(fā)展，固定化過氧化氫酶在各個領(lǐng)域的應(yīng)用范圍必將不斷擴(kuò)大。

42卷34期

徐 娟等 過氧化氫酶的研究和固定化及其應(yīng)用進(jìn)展

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