劉召亮等

摘 要 為研究芒果MiRab11蛋白的互作及其它生物學功能，本文在MiRab11基因序列基礎上，采用重疊PCR定點突變技術，獲得了2個結構域突變體Mi-Rab11CA和Mi-Rab11DN，將其構建原核表達載體，并成功轉化大腸桿菌BL21。SDS-PAGE結果顯示，在28 ℃條件下，用0.5 mmol/L IPTG誘導4 h，可獲得大量可溶性蛋白的表達。將可溶性蛋白經(jīng)Ni-NTA argrose層析柱純化并western blot鑒定，該重組蛋白均可與抗His單克隆抗體發(fā)生特異性免疫反應。本研究為深入研究芒果pET-Rab11蛋白生理活性、特異性結合位點及功能調控打下良好基礎。

關鍵詞 芒果；MiRab11；突變體蛋白；原核表達；純化；鑒定

中圖分類號 S667.7 文獻標識碼 A

Abstract In order to study the interaction of MiRab11 with proteins and other biological functions overlapping PCR was applied to obtain two mutant（MiRab11CA and MiRab11DN）based on the known sequence of MiRab11. And the prokaryotic expression vectors of pET-Rab11， pET-Rab11CA， and pET-Rab11DN were successfully constructed and transformed into E.coli BL 21（DE3）. SDS-PAGE results showed that the fusion protein were expressed induced by 0.5 mmol/L IPTG， at 28 ℃ for 4 hours in E.coli BL21. And these soluble proteins could be purified by chromatography on nickel agarose column. Western blotting demonstrated that the recombinant fusion proteins can be recognized by anti-6-His monoclonal antibody. These results provide the basis for the studies of the physiological activity and the specific binding site and the function regulation of the MiRab11 protein.

Key words Mango； MiRab11 gene； Mutant proteins； Prokaryotic expression； Protein purification； Identification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.012

Rab家族是Ras蛋白超家族中最大最復雜的小G蛋白成員，普遍存在于真核細胞，定位于細胞內與胞吞和胞吐相關的不同的膜區(qū)室上，起分子開關作用，調節(jié)囊泡的形成、轉運、粘附和融合過程[1-2]，廣泛調控植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成、逆境脅迫反應等[3]；轉AtRab7基因擬南芥可明顯提高對鹽的耐受性[4]；AvrPto因子可以與Rab蛋白發(fā)生互作，破壞番茄RabE蛋白調節(jié)的膜運輸途徑，使植物感病[5]。Rab11是Rab家族成員中數(shù)量最多、功能最多樣化的亞家族[6-7]。擬南芥基因組中有57個Rab，其中26個為rab11亞家族成員；葡萄基因組中存在26個Rab，其中rab11為14個[8-9]。芒果MiRabX基因特異性表達于成熟果實中，以此序列為探針，獲得番茄SlRab11，反義番茄不能正常成熟[10-11]。煙草NtRab11基因與花粉管的極性生長密切相關[12]。轉水稻OsRab11基因擬南芥及其突變體對鹽的耐受性明顯提高[13]。百脈根基因組中存在10個LcRab11基因，其中4個與根瘤的形成有關[14]。

在前期對芒果進行逆境相關基因差異顯示分析中[15]，從芒果逆境脅迫組織中分離獲得了一個Rab蛋白家族成員MiRab11，該基因可能與果實成熟，環(huán)境脅迫和信號轉導相關。為進一步分析其基因蛋白功能，本文采用定點突變技術與原核表達，構建、表達和純化了MiRab11的原核表達蛋白及其結構域突變蛋白，并經(jīng)Western Blot證實，上述重組蛋白均可與抗His單克隆抗體發(fā)生特異性結合反應。為深入研究芒果MiRab11基因蛋白生理活性、特異性結合位點及功能調控打下良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 大腸桿菌DH5α和宿主菌BL21（DE3）細胞購于北京全式金生物公司；原核表達載體pET-30a由廣西大學亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室王凜饋贈。pMD-18T載體購自TaKaRa。

1.1.2 試劑 限制性內切酶BamHⅠ、SalⅠ、Taq DNA聚合酶、dNTPs等都購自于Fermentas公司（加拿大）；M-MLV逆轉錄、RNase H、pMD-18T載體、Ligation Kit Ver.2.1均購自TaKaRa；蛋白預染marker、氨節(jié)青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、IPTG購于上海生工；質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自Bioer公司；Ni金屬螯合柱和試劑均購自Qiagen 公司；鼠源His標簽抗體、山羊抗鼠IgG購自TIANGEN 公司（北京）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。引物合成及序列測定由上海生工完成。

1.2 方法

1.2.1 MiRab11基因CDS的克隆 根據(jù)已克隆的MiRab11基因全長cDNA序列（GenBank登錄號為KF768564），設計包含酶切位點的上游和下游引物與定點突變引物（表1）。以芒果果實cDNA為模板，通過高保真Dream Taq聚合酶PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的片段，連接到pMD-18T載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞后，經(jīng)藍白斑篩選和菌液PCR檢測陽性后，進行測序。

1.2.2 MiRab11基因結構域定點突變體片段的擴增

基因突變體片段擴增，參照Ho等[16]重疊PCR定點突變技術。用包含MiRab11基因的大腸桿菌菌株質粒作為模板，以MCF引物與Erab11R引物和MCR引物與Erab11F引物，分別進行第一輪PCR，將產(chǎn)物分別稀釋100倍后，各取1 μL作為第二輪PCR的模板，以Erab11F和Erab11R引物進行第二輪PCR，即可得到Erab11的突變片段MiRab11CA（Q72L）。同理，可得到Erab11的突變片段MiRab11DN（S27N）。

1.2.3 重組表達載體的構建 以測序正確的重組pMD18-T-Rab11、pMD18-T-Rab11CA和pMD18-T-Rab11DN菌株提取質粒，用BamHⅠ與 SalⅠ分別雙酶切表達載體pET-30a（+）和上述提取的質粒，回收線性載體片段和目的基因片段，用SolutionⅠ連接后，將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。菌液PCR和測序檢測正確后，提取質粒。經(jīng)BamHⅠ與 SalⅠ雙酶切驗證無誤后，將質粒轉化原核表達菌株BL21，篩選陽性菌株，用于重組蛋白表達。

1.2.4 基因原核表達分析 將上述重組表達質粒和空載體pET-30a（+）分別轉化大腸桿菌BL21（DE3），挑取單菌落接種于終濃度為50 mg/mL Kan的LB培養(yǎng)基（20 mL）中，37 ℃ 培養(yǎng)過夜，以1 ∶ 50的比例加入含Kan的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600約為0.8時，用終濃度為0.5 mmol/L誘導劑IPTG 28 ℃誘導4 h。收集2 mL菌液，12 000 r/min ，離心5 min，用80 μL PBS（pH7.4）懸浮，加入5×SDS-Loading Buffer 20 μL，混勻后置冰上10 min，煮沸10 min，12 000 r/min，離10 min，取10 μL上清進行15% SDS-PAGE電泳分析誘導蛋白表達情況，以pET30a（+）空載體轉化菌樣品、BL21菌樣品和未經(jīng)誘導的轉化菌為對照。

1.2.5 重組蛋白的純化與Western Blot檢測 將上述重組陽性菌株pET-Rab11、pET-Rab11CA和pET-Rab11DN按同樣的條件誘導蛋白表達后，收集菌體，重懸于含有蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液中，超聲破碎至菌液澄清，離心收集上清。將收集的上清過Ni-NTA小柱，得到純化的重組蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳，電轉至硝酸纖維素膜上，封閉液室溫封閉90 min后4 ℃過夜；加入1 ∶ 5 000稀釋的鼠抗6×His的單抗，室溫反應2 h；TBS洗滌后，加入1 ∶ 5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠抗體室溫反應1.5 h；充分洗滌，加入新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液；待顯色條帶清晰后立即用蒸餾水洗滌硝酸纖維素膜。同時設BL21菌和pET30a（+）空載體轉化菌樣品對照。

2 結果與分析

2.1 MiRab11基因CDS片段及結構域突變體的擴增

MiRab11基因編碼的蛋白具有Rab家族保守的G1-G5結構域，其中G1（GDSGVGKS）和G3（DTAGQE）結構域，與GTP的結合有關。通過定點突變結構域中的特定氨基酸，可以突變產(chǎn)生激活態(tài)和失活態(tài)的Rab蛋白。通過定點突變重疊PCR技術可獲得包含酶切位點的MiRab11基因CDS片段及結構域突變體。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，突變體MiRab11CA和MiRab11DN的第一輪PCR產(chǎn)物電泳（圖1-a），經(jīng)過兩輪PCR后，得到結構域突變MiRab11CA和MiRab11DN。結果顯示兩突變體與未突變的MiRab11基因CDS片段大小相等，均約為660 bp，與預期結果相符（圖1-b）。

2.2 原核表達載體的構建

提取原核重組的陽性表達菌株pET-Rab11、pET-Rab11CA和pET-Rab11DN質粒，用BamHⅠ與SalⅠ分別雙酶切，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果顯示，上述質粒均可得與預期結果相符的目的片段，大小約為660 bp（圖2）。結果表明，原核重組表達質粒構建成功。

2.3 原核表達載體的表達

重組表達載體轉化大腸桿菌，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)至OD600約為0.8時，用終濃度為0.5 mmol/L誘導劑IPTG 28 ℃，180 r/min，誘導4 h后，取樣進行SDS-PAGE電泳分析。結果顯示，重組質粒在大腸桿菌BL 21中得到表達，表達的重組蛋白為融合蛋白，分子量約為25 ku（圖3），與理論值大小相符。

2.4 重組蛋白純化與蛋白印跡分析

純化的重組蛋白pET-Rab11、pET-Rab11DN、pET-Rab11CA與小鼠6×His的單克隆抗體進行Western Blot分析。結果顯示，上述重組蛋白在約25 ku處均出現(xiàn)特異性條帶（圖4），而空白BL 21和pET30a-BL21總蛋白在同一處沒有出現(xiàn)特異性條帶。

3 討論與結論

結合原核蛋白表達和定點突變技術是研究蛋白功能的有效方法，通過對Rab蛋白的功能結構域的突變能有效推斷蛋白結構域的功能。根據(jù)Rab家族成員具有的保守結構域，分別突變與GTP結合有關典型結構域的G1（GDSGVGKS）和G3（DTAGQE），定點突變這些結構域的特定氨基酸，可以產(chǎn)生失活和激活狀態(tài)下的Rab蛋白突變體，如煙草突變體Rab11b（S28N）和Rab11b（Q73L）均不同程度地影響花粉管的生長；番茄突變體LeRab11a表達可以負調控細胞的分泌活動[17-18]。為研究MiRab11的功能，對該基因及突變體原核表達分析，pET-Rab11及突變體pET-Rab11DN和pET-Rab11CA，經(jīng)誘導均可獲得特異性表達。一般而言，異源真核基因在大腸桿菌中容易受密碼子偏好表達影響[15]。本實驗結果表明，pET-Rab11及其結構域突變蛋白不受密碼子偏好性問題的影響，能夠在大腸桿菌中大量特異性表達。一方面，由于Rab11蛋白保守的結構決定了其理化性質，蛋白編碼區(qū)內不存在信號肽，有跨膜結構[16]，如條斑紫菜Rab11基因構建原核pET-28a表達重組載體可以在大腸桿菌BL 21中成功表達該蛋白[17]；另一方面，使用的高效表達載體pET-30a具有功能強大的 T7 啟動子，可以使大多數(shù)的細胞資源在誘導充分條件下，被用于目的基因的表達，可獲得高效表達的重組蛋白[18]。此外，pET-30a載體含有的6×His標簽作為純化的標識，其His融合蛋白經(jīng)過Ni-NTA argrose層析柱容易純化。純化的蛋白經(jīng)Western Blot表明，均可與抗His單克隆抗體發(fā)生特異性結合反應。

總之，由于直接從芒果樹體內分離純化MiRab11蛋白，難度大，獲取量少，不能滿足制備MiRab11蛋白多克隆抗體等實驗的需要。本研究通過重疊PCR定點突變技術對MiRab11蛋白的功能結構域進行突變，結合原核表達分析獲得了大量純化的MiRab11蛋白及突變蛋白MiRab11DN和MiRabCA，為深入研究芒果MiRab11蛋白生理活性，特異性結合位點及功能調控打下了良好基礎。

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