黃和 林曉霞 鄺高波 曹湛慧

摘 要 采用UPLC-MS/MS法對(duì)番石榴多酚中部分酚類物質(zhì)進(jìn)行了定性分析。以抑菌圈直徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，測(cè)定了番石榴多酚的抑菌活性，并以金黃色葡萄球菌為指示菌，對(duì)其抑菌穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：番石榴多酚中含有沒(méi)食子酸、兒茶素、槲皮素、原兒茶酸、山奈素和綠原酸等酚類物質(zhì)。番石榴多酚對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏桿菌、單增李斯特菌、銅綠假單胞菌、腐敗希瓦氏菌和枯草芽孢桿菌具有較好的抑制效果，除了單增李斯特菌和腐敗希瓦氏菌的MIC低于5 mg/mL外，其余均低于2.5 mg/mL。番石榴多酚在pH4～5范圍內(nèi)處理后抑菌活性最強(qiáng)，其抑菌活性對(duì)溫度、紫外照射具有穩(wěn)定性，低鹽度會(huì)促進(jìn)其抑菌活性。

關(guān)鍵詞 番石榴多酚；酚類物質(zhì)分析；抑菌活性

中圖分類號(hào) TS255.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

番石榴（Psidium guajava L.）屬于桃金娘科番石榴屬，嗜熱畏寒，為亞熱帶水果，在我國(guó)廣東、廣西、福建均有種植，其味清香可口，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。微生物是引起食物腐敗的一個(gè)重要因素，不僅降低食物感官品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，產(chǎn)生的毒素更會(huì)危害人體健康。在食品工業(yè)領(lǐng)域，防止食物腐敗的方法有冷藏、殺菌、密封包裝、添加防腐劑等，以延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期[2-4]。防腐劑分為化學(xué)合成防腐劑和天然活性防腐劑，合成防腐劑價(jià)格低廉、效果顯著，但具有潛在的安全問(wèn)題，因此天然防腐劑的研究受到越來(lái)越廣泛的重視。植物多酚類物質(zhì)具有抑菌活性，據(jù)報(bào)道蘋果多酚對(duì)細(xì)菌具有較強(qiáng)的抑制作用[5]，葡萄多酚對(duì)金黃色葡萄球菌、志賀氏痢疾桿菌、沙門氏菌、大腸埃希氏桿菌等具有抑制作用[6]，而番石榴果肉多酚的抑菌活性在國(guó)內(nèi)外并無(wú)系統(tǒng)的研究。本研究采用牛津杯法測(cè)定了番石榴多酚的抑菌活性，并同時(shí)測(cè)定了其抑菌穩(wěn)定性，旨為天然防腐劑提供另一種可行性選擇。目前關(guān)于番石榴多酚的成分鑒定及定量研究尚屬空白，而且多酚類物質(zhì)種類繁多，有待進(jìn)一步對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行鑒定。本文運(yùn)用HPLC和UPLC-MS/MS測(cè)定了番石榴多酚中的部分酚類物質(zhì)，可為其進(jìn)一步化學(xué)成分鑒定提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番石榴購(gòu)于湛江沃爾瑪超市，產(chǎn)地湛江；大腸埃希氏桿菌（Escherichia coli，G-），金黃色葡萄球菌（Staphy lococcus aureus，G+），副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus，G-），單增李斯特菌（Listeria spp，G+），銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，G-），腐敗希瓦氏菌（Hewanella putrefacens，G-），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，G+）取自廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；山梨酸鉀（化學(xué)純）出自中國(guó)醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司；色譜純甲醇出自天津市協(xié)和昊鵬色譜科技有限公司；乙酸為廣東光華化學(xué)廠有限公司；槲皮素，沒(méi)食子酸，兒茶素，綠原酸，阿魏酸，咖啡酸，原兒茶酸來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；山奈素，根皮苷購(gòu)于北京金寶在線科技有限公司，試劑都為色譜純級(jí)。

超凈工作臺(tái)（潔凈等級(jí)100級(jí)）出自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SPX-250-Z型生化培養(yǎng)箱出自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BL-620S電子天平出自日本Shimadzu公司；YX-280 型手提式壓力蒸汽消毒器出自江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠；TSQ Quantum Access液質(zhì)聯(lián)用儀（ESI）出自美國(guó)Thermo公司；色譜柱為UPLC ACQUITY BEH，50 mm×2.1 mm，1.7 μm；

1.2 方法

1.2.1 番石榴多酚組分的分離及分析 番石榴多酚的制備：微波輔助法提取番石榴多酚[7]，粗提物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮備用。采用NKA-9大孔吸附樹(shù)脂純化番石榴多酚[8]，然后用Sephadex LH-20葡聚糖凝膠進(jìn)一步分離[9]，得到4個(gè)不同組分：GP1、GP2、GP3和GP4。

UPLC-MS測(cè)定番石榴多酚組分：將Sephadex LH-20葡聚糖凝膠分離番石榴多酚后得到的4個(gè)組分用色譜純甲醇定容至1 μg/mL，槲皮素、沒(méi)食子酸、兒茶素等標(biāo)品用少量色譜純甲醇濕潤(rùn)后，配制成1 mg/mL母液，取各自母液1 mL定容至1 μg/mL，得到標(biāo)準(zhǔn)液，4 ℃保存?zhèn)溆?。采用UPLC-MS對(duì)番石榴多酚分離組分GP1、GP2、GP3和GP4中部分簡(jiǎn)單酚類成分進(jìn)行測(cè)定，條件如下：

流動(dòng)相：乙腈（A）/0.1甲酸水溶液（V ∶ V）；梯度洗脫程序?yàn)椋?～1 min，20% A；1～3 min，20%～50% A；3～4 min，90% A保持1 min。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；

進(jìn)樣量：10 μL；離子源：ESI，負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：4.0 kV；離子源溫度：110 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；錐孔反吹氣流量：50 L/h；錐孔電壓：40 V；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。

1.2.2 番石榴多酚抑菌活性測(cè)定 菌懸液的制備：將供試菌株劃線于無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面后于37 ℃下培養(yǎng)24～36 h，在無(wú)菌條件下向已活化好的供試菌株瓊脂斜面中加入10 mL無(wú)菌生理鹽水，輕輕刮松菌苔，渦旋振蕩器振蕩混勻，用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行10倍稀釋，制成初始稀釋菌懸液，濃度為106～107 cfu/mL，備用。

抑菌活性定性試驗(yàn)：稱取6 g素瓊脂于300 mL蒸餾水中加熱溶解，分裝于3個(gè)250 mL三角瓶中高壓滅菌，冷卻至50 ℃左右時(shí)，在超凈工作臺(tái)上倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿約5 mL，水平放置，讓其均勻鋪滿培養(yǎng)皿底部，凝固后在平板上均勻擺放4個(gè)無(wú)菌牛津杯（外徑8 mm，內(nèi)徑6 mm）備用。

取營(yíng)養(yǎng)瓊脂33 g于1 L水中加熱完全溶解，分裝在100 mL三角瓶中滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右時(shí)，取2 mL各菌懸液分別加入培養(yǎng)基中搖勻，趁熱將沒(méi)凝固的含菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入擺放了牛津杯的素瓊脂平板上層，每個(gè)平板約10 mL，水平放置均勻鋪滿平板，待凝固后取下牛津杯，向含不同測(cè)試菌平板的牛津杯孔中分別加入前面制備好的80 μL 10、5、2 mg/mL的番石榴多酚溶液，以無(wú)菌水為對(duì)照，細(xì)菌于37 ℃左右培養(yǎng)24 h，真菌培養(yǎng)48 h后觀察有無(wú)抑菌圈，游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈大小（測(cè)定抑菌透明圈的直徑），平行試驗(yàn)3次，以無(wú)菌水溶液為空白對(duì)照。

最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定：采用二倍稀釋法將番石榴多酚溶液稀釋成濃度50、25、12.5、6.25、3.125 mg/ml的梯度溶液，滅菌后分別取1 mL加入9 mL含有各測(cè)試菌的融化營(yíng)養(yǎng)瓊脂中混勻，使其濃度為5、2.5、1.25、0.625和0.312 5 mg/mL，倒平板在37 ℃左右培養(yǎng)24 h，觀察菌體生長(zhǎng)情況，以確定作為最低抑菌濃度，以山梨酸鉀溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌水測(cè)試菌作為空白對(duì)照，平行3次。

pH值對(duì)番石榴多酚的抑菌效果：配制pH分別為2～3、3～4、4～5、5～6、6～7、7～8、8～9的5 mg/mL的番石榴多酚溶液，處理適當(dāng)時(shí)間后，將pH重新調(diào)回至中性，以金黃色葡萄球菌為指示菌，按前述抑菌活性定性試驗(yàn)方法測(cè)定不同pH處理番石榴多酚后對(duì)抑菌效果影響，平行試驗(yàn)3次。

番石榴多酚抑菌活性的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)：將5 mg/mL的番石榴多酚溶液分別于60、70、80、90 ℃水浴以及于121 ℃加熱20 min，以金黃色葡萄球菌為指示菌，按前述抑菌活性定性試驗(yàn)方法分別測(cè)定不同溫度處理后的番石榴多酚的抑菌效果，以測(cè)定番石榴多酚抑菌活性的熱穩(wěn)定性，平行試驗(yàn)3次。

鹽對(duì)番石榴多酚抑菌效果的影響：5 mg/mL的番石榴多酚溶液配制成分別含有0.1%、0.3%、0.6%、0.9%氯化鈉的待試液，以含同等濃度氯化鈉的無(wú)菌水作為空白對(duì)照組，金黃色葡萄球菌為指示菌，按前述抑菌活性定性試驗(yàn)方法測(cè)定無(wú)機(jī)鹽對(duì)抑菌效果的影響。

紫外輻射對(duì)番石榴多酚抑菌活性的影響：將5 mg/mL番石榴多酚溶液放置于超凈工作臺(tái)上紫外照射0、10、20、30、40、50、60 min，以無(wú)菌水溶液為對(duì)照，金黃色葡萄球菌為指示菌，按前述抑菌活性定性試驗(yàn)方法測(cè)定紫外照射對(duì)番石榴多酚抑菌穩(wěn)定性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC-MS測(cè)定番石榴多酚

標(biāo)準(zhǔn)品UPLC-MS/MS色譜圖和質(zhì)譜參數(shù)分別見(jiàn)圖1和表1。根據(jù)上述UPLC-MS/MS條件以及離子碎片信息，對(duì)番石榴多酚進(jìn)行定性測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。番石榴多酚經(jīng)葡聚糖凝膠純化得到的4個(gè)組分中均含有山奈素，兒茶素，沒(méi)食子酸，原兒茶酸，GP1中沒(méi)食子酸含量最高（69.4 mg/kg），其次是兒茶素（23.99 mg/kg），山奈素含量最低，綠原酸為其特有成分；GP2中沒(méi)食子酸含量為529.74 mg/kg，在4個(gè)組分中含量最高；GP3中兒茶素（2 191.49 mg/kg）含量最多，均高于其它組分，但山奈素含量低于另外3個(gè)組分（0.25 mg/kg）；槲皮素是GP4中特有成分，含量為32.38 mg/kg。

2.2 抑菌活性定性試驗(yàn)

番石榴多酚抑菌效果的定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)表中各成分對(duì)供試菌種的抑菌圈大小，可以看出番石榴多酚具有一定的抑菌活性，具有較為廣泛的抑菌譜。在試驗(yàn)濃度內(nèi)，對(duì)受試菌種大腸埃希氏桿菌、金黃色葡萄球菌、腐敗希瓦氏菌、單增李斯特菌、銅綠假單胞菌都具有抑制活性，對(duì)副溶血弧菌沒(méi)有抑制活性。番石榴多酚的濃度和抑菌圈大小具有劑量關(guān)系，濃度越大抑制效果越明顯，當(dāng)濃度降至2 mg/mL時(shí)，只對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌以及枯草芽孢桿菌具有抑制作用，空白對(duì)照組沒(méi)有觀察到抑菌圈。

2.3 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

番石榴多酚對(duì)各供試菌的最低抑菌濃度見(jiàn)表4。銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的MIC低于1.25 mg/mL，大腸桿菌的MIC低于2.5 mg/mL，單增李斯特菌和腐敗希瓦氏菌的MIC低于5 mg/mL，番石榴多酚對(duì)單增李斯特菌和腐敗希瓦氏菌的抑制活性低于其他幾種供試菌。防腐劑山梨酸鉀對(duì)單增李斯特菌的MIC低于5 mg/mL，其余的都低于2.5 mg/mL，番石榴多酚對(duì)供試菌的抑菌活性和對(duì)照品防腐劑的抑菌活性相當(dāng)，甚至略優(yōu)于山梨酸鉀，說(shuō)明番石榴多酚具有成為新型天然活性防腐劑的潛力。

2.4 不同pH值對(duì)番石榴多酚的抑菌效果的影響

以金黃色葡萄球菌為指示菌，不同pH處理后的番石榴多酚的抑菌效果如圖2。酸性條件處理后番石榴多酚的抑菌效果比在堿性條件處理后強(qiáng)，在pH4～5范圍內(nèi)處理后抑菌活性最高，pH超過(guò)8以后，抑菌效果急速下降。分析這是因?yàn)槎喾宇愇镔|(zhì)自然情況下屬于酸性物質(zhì)，在堿性環(huán)境中結(jié)構(gòu)會(huì)遭到破壞而引起抑菌效果的減弱，總體上看番石榴多酚在較廣的pH范圍內(nèi)抑菌效果較好。

2.5 番石榴多酚抑菌活性的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

番石榴多酚抑菌活性的熱穩(wěn)定性效果見(jiàn)圖3。在60～121 ℃范圍內(nèi)，抑菌圈直徑波動(dòng)很?。╬>0.05），其抑菌熱穩(wěn)定性較好，適合添加在需熱處理的食品中作為天然防腐劑。

2.6 鹽濃度對(duì)番石榴多酚抑菌效果的影響

低濃度鹽對(duì)番石榴多酚抑菌效果影響見(jiàn)圖4。鹽對(duì)番石榴多酚的抑菌效果具有一定的促進(jìn)作用，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，濃度越高，抑菌圈直徑越大，而相同鹽濃度的各對(duì)照組均沒(méi)有觀察到明顯的抑菌圈，說(shuō)明抑菌活性的增加不太可能是滲透壓增高而引起的，具體原因有待進(jìn)一步研究。

2.7 紫外輻射對(duì)番石榴多酚抑菌活性的影響

紫外輻射對(duì)番石榴多酚抑菌活性影響見(jiàn)圖5。從圖5可以得出，在試驗(yàn)條件內(nèi)番石榴多酚對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制活性不受紫外照射的影響（p>0.05），這個(gè)條件下番石榴多酚結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，這可能是因?yàn)榉穸喾颖旧砭哂斜江h(huán)結(jié)構(gòu)，在紫外區(qū)具有強(qiáng)吸收峰，結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定不至于受影響，從而保證了抑菌活性的穩(wěn)定[10]。

3 討論與結(jié)論

通過(guò)HPLC和UPLC-MS/MS對(duì)番石榴多酚中酚類成分進(jìn)行定性和定量分析，發(fā)現(xiàn)其中含有沒(méi)食子酸、槲皮素、山奈素、兒茶素、原兒茶酸和綠原酸等酚類物質(zhì)。其另外成分需繼續(xù)鑒定。

番石榴多酚對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏桿菌、單增李斯特菌、銅綠假單胞菌、腐敗希瓦氏菌和枯草芽孢桿菌具有較好的抑制效果，除了單增李斯特菌和腐敗希瓦氏菌的MIC低于5 mg/mL外，其余均低于2.5 mg/mL。番石榴多酚在pH為4～5范圍內(nèi)的抑菌活性最強(qiáng)，其抑菌活性對(duì)溫度、紫外照射具有穩(wěn)定性，低鹽度會(huì)促進(jìn)其抑菌活性。

植物多酚的抑菌機(jī)理目前并不明確，大量研究表明可能是通過(guò)以下途徑來(lái)達(dá)到抑菌效果[11]：植物多酚與細(xì)菌蛋白質(zhì)結(jié)合；抑制細(xì)菌酶的合成；結(jié)合微生物生長(zhǎng)必需物，造成微生物死亡；多酚的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)賦予其良好的金屬離子結(jié)合能力，與鐵離子結(jié)合而破壞微生物新陳代謝。與蘋果多酚、葡萄多酚等其他植物多酚的抑菌活性[5-6]相比，番石榴多酚也具有較好的抑菌活性，可作為天然防腐劑使用，并且原料價(jià)格便宜，來(lái)源容易。但是作為一種復(fù)合物，其具體是番石榴多酚中的哪幾種成分具有抑菌活性，以及具體抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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責(zé)任編輯：葉慶亮