摘 要：以羅漢果‘伯林3號(hào)為材料，研究適宜其離體保存的B9濃度。結(jié)果表明，B9對(duì)株高、節(jié)間長(zhǎng)度有明顯抑制作用，且隨濃度升高抑制作用增強(qiáng)，隨保存時(shí)間延長(zhǎng)抑制作用減輕；對(duì)增殖系數(shù)則無(wú)顯著影響；存活率在保存60天后隨時(shí)間延長(zhǎng)明顯下降。保存后試管苗恢復(fù)培養(yǎng)的存活率都為100%，形態(tài)正常。B9濃度為400 mg/L時(shí)，保存180天存活率最高（70%），且能顯著抑制試管苗的株高和節(jié)間長(zhǎng)度，莖粗壯，是其離體保存的最適宜濃度。

關(guān)鍵詞：羅漢果；試管苗；離體保存；B9

中圖分類號(hào)：Q943.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 論文編號(hào)：2014-0068

Abstract： The most appropriate concentration of B9 was screened for the in vitro conservation by using the Siraitia grosvenorii ‘Bolin 3rd as material. The results showed that： different concentrations of B9 inhibited plant height， internode length significantly， and the inhibition degree increased with the concentration， inhibition gradually alleviated with the elongation of conservation； but it had no significant impact on multiplication coefficient， the survival rate decreased obviously after 60 days. The survival rates on recovery culture were 100% after saving in different concentrations of B9， and their morphology was normal. When the concentration of B9 was 400 mg/L， it had the highest survival rate （70%） after saving 180 days， and could inhibit the plant height and internode length notably， its stems were strong. The most appropriate concentration for its in vitro preservation was 400 mg/L.

Key words： Siraitia grosvenorii； Test Tube Shoots； in vitro Conservation； B9

0 引言

羅漢果Siraitia grosvenorii屬葫蘆科（Cucurbitaceae）羅漢果屬（Siraitia），為多年生宿根草質(zhì)藤本植物，是廣西的重要經(jīng)濟(jì)作物，也是中國(guó)出口創(chuàng)匯的重要果品之一。廣西永福、臨桂和龍勝等縣為羅漢果的主要產(chǎn)區(qū)[1-2]。羅漢果長(zhǎng)期進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖，目前種質(zhì)退化、流失嚴(yán)重。

緩慢生長(zhǎng)法是植物種質(zhì)離體保存的重要方式，通過降低溫度、光強(qiáng)、氧分壓、養(yǎng)分或調(diào)節(jié)滲透壓、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等直接限制離體培養(yǎng)物的生長(zhǎng)以延長(zhǎng)繼代的間隔[3-4]。其中，添加植物生長(zhǎng)延緩劑矮壯素（CCC）、多效唑（PP333）、丁酰肼（B9）等使用最為廣泛[5-6]。B9通常由植物葉和莖吸收進(jìn)體內(nèi)，然后傳導(dǎo)到作用部位，能抑制新梢生長(zhǎng)，縮短節(jié)間長(zhǎng)度等[7]。添加B9在黃獨(dú)、馬鈴薯種質(zhì)資源的離體保存中獲得成功[8-9]，而B9對(duì)羅漢果離體保存的影響還未見報(bào)道。筆者對(duì)羅漢果進(jìn)行緩慢生長(zhǎng)離體保存的研究，篩選出最適宜B9濃度，以期為羅漢果種質(zhì)保存和利用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

研究室內(nèi)試驗(yàn)于2012—2013年在廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

廣西伯林生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供的羅漢果‘伯林3號(hào)品種果實(shí)。

1.3 試驗(yàn)方法

參照劉華英等[10]的方法，從果實(shí)取出種子進(jìn)行培養(yǎng)獲得無(wú)菌苗并繼代增殖。選生長(zhǎng)健壯、一致的繼代培養(yǎng)植株，截取1～1.5 cm的莖段，進(jìn)行離體保存。以1/2MS+ 7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖+0.4 mg/L 6-BA+ 0.04 mg/L NAA添加不同量的B9（0、100、200、400、600 mg/L）為保存培養(yǎng)基，pH 6.0，用塑料膜封口。光照強(qiáng)度2400 lx，溫度（25±2）℃，光照12 h/d。每處理6瓶，每瓶5株，3次重復(fù)。每30天觀察記錄試管苗的增殖系數(shù)、節(jié)間數(shù)、株高、存活率。180天后，再把試管苗切取莖段在繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，40天后觀察記錄每種處理的存活和生長(zhǎng)情況。所得數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同B9濃度對(duì)羅漢果‘伯林3號(hào)試管苗株高的影響

由表1可見，保存相同的時(shí)間，隨著B9濃度的升高，株高均逐漸降低，即B9對(duì)試管苗的株高有抑制作用。而隨保存時(shí)間延長(zhǎng)，各處理的株高呈不同程度的增加，增幅隨B9濃度增加而降低，株高間的差異則隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少，保存180天時(shí)只有較高濃度的B9（400～600 mg/L）對(duì)試管苗的株高有顯著的抑制作用?？梢?，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，B9對(duì)株高的抑制作用有逐漸減弱的趨勢(shì)。

2.2 不同B9濃度對(duì)羅漢果‘伯林3號(hào)試管苗節(jié)間長(zhǎng)度的影響

隨著B9濃度的升高，試管苗的節(jié)間長(zhǎng)度逐漸降低（表2），說明B9的濃度越高，對(duì)節(jié)間伸長(zhǎng)的抑制作用越強(qiáng)。隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，節(jié)間長(zhǎng)度都有所增加。B9濃度為600 mg/L時(shí)，保存至120天芽都表現(xiàn)為蓮座狀叢生，難以分辨其芽數(shù)和節(jié)間數(shù)，未作統(tǒng)計(jì)。保存180天時(shí)，較高濃度B9（400～600 mg/L）對(duì)節(jié)間的伸長(zhǎng)仍有顯著的抑制作用。

2.3 不同B9濃度對(duì)羅漢果‘伯林3號(hào)試管苗增殖系數(shù)的影響

由表3可見，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理的增殖系數(shù)呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)。B9濃度為100 mg/L時(shí)的增殖系數(shù)低于對(duì)照（90天時(shí)除外）；B9濃度大于100 mg/L時(shí)的增殖系數(shù)在保存30、60、180天時(shí)呈增加趨勢(shì)，保存90、120天時(shí)先增加后降低，保存150天時(shí)先減少后升高，但都沒有顯著性差異。結(jié)果表明，保存期間，B9對(duì)試管苗的增殖系數(shù)無(wú)顯著影響。

2.4 不同B9濃度對(duì)羅漢果‘伯林3號(hào)試管苗存活率的影響

保存30～60天時(shí)，各處理試管苗的存活率均為100%（表4），部分植株的葉片開始變黃。保存90天時(shí)，除B9濃度為100 mg/L外，其余各處理的存活率均明顯下降。隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)存活率均逐漸降低，保存180天時(shí)B9濃度為400 mg/L的存活率最高為70%，除B9濃度為600 mg/L的存活率顯著降低外，其余處理間沒有顯著性差異。

2.5 不同B9濃度對(duì)羅漢果‘伯林3號(hào)試管苗保存后恢復(fù)生長(zhǎng)的影響

由表5可見，600 mg/L B9處理的增殖系數(shù)、節(jié)間數(shù)和株高均顯著低于其他處理；其他各處理的隨著B9濃度的升高各指標(biāo)降低，但無(wú)顯著性差異。說明高濃度的B9（600 mg/L）強(qiáng)烈抑制植株的生長(zhǎng)，這種抑制效應(yīng)延續(xù)到了恢復(fù)生長(zhǎng)，因此，不適用于其保存。保存后恢復(fù)培養(yǎng)的試管苗存活率均為100%，植株葉形、葉色與繼代苗一致，即沒有發(fā)生形態(tài)上的變異。

3 結(jié)論與討論

緩慢生長(zhǎng)法離體保存已在愈傷組織、未成熟胚、種子、頂端分生組織、帶芽莖段等材料中開展研究，為減少體細(xì)胞變異并具有高的再生能力，離體保存一般使用帶芽莖段或不定芽[4-5，11-12]。向培養(yǎng)基中添加適宜濃度的植物生長(zhǎng)延緩劑不僅能延長(zhǎng)培養(yǎng)物在試管中的保存時(shí)間，而且能提高試管苗素質(zhì)和移植成活率，是植物種質(zhì)資源保存的有效方法[13]。研究表明，不同植物和品種對(duì)植物生長(zhǎng)延緩劑的應(yīng)答不同，如弄崗唇柱苣苔離體保存效果為CCC>B9>PP333[6]；添加5 mg/L CCC、0.1 mg/L ABA或60 mg/L B9對(duì)蘋果‘中砧1號(hào)組培苗則具有相同的效果[14]。趙建萍等[9]的研究表明，B9作為高效低毒的植物生長(zhǎng)延緩劑，可抑制試管苗頂端優(yōu)勢(shì)，從而有效提高繁殖系數(shù)。本試驗(yàn)添加不同濃度的B9對(duì)羅漢果試管苗的增殖系數(shù)無(wú)顯著影響，可能與所用的B9濃度有關(guān)。不同物種離體保存時(shí)適宜的B9濃度差別很大，黃獨(dú)種質(zhì)離體保存最佳B9濃度為4 mg/L[8]，在培養(yǎng)基中加入B9 50 mg/L能夠有效地抑制獼猴桃試管苗的生長(zhǎng)[15]，200 mg/L B9會(huì)使蘋果轉(zhuǎn)接苗抑制過度而死亡[16]。而100～200 mg/L B9處理對(duì)羅漢果試管苗的株高抑制較弱，且保存180天時(shí)存活率較低；高濃度的B9（600 mg/L）強(qiáng)烈抑制其生長(zhǎng)，導(dǎo)致形成的試管苗節(jié)間縮短、蓮座狀簇生，存活率低，恢復(fù)生長(zhǎng)差；400 mg/L B9處理存活率最高，顯著抑制株高和節(jié)間長(zhǎng)度，莖粗壯，恢復(fù)培養(yǎng)生長(zhǎng)良好，是羅漢果‘伯林3號(hào)離體保存適宜的B9濃度。

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