王曉英 王長憲

摘 要：為從分子水平上研究蘭屬植物的遺傳多樣性和建立適合的分子標(biāo)記反應(yīng)體系。本研究采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，對蘭屬植物的9個(gè)品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，篩選得到的8對引物共擴(kuò)增出965條DNA片段，其中多態(tài)性條帶為931條，平均1對引物擴(kuò)增條帶121條（多態(tài)性帶116條），多態(tài)性位點(diǎn)頻率為95.87%，說明遺傳多樣性豐富。用NTSYS2·10進(jìn)行UPGMA聚類分析，屬于同種的品種聚在一起，與表型分類基本吻合。蘭屬植物間遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.416～0.606。此分子標(biāo)記技術(shù)體系可為蘭屬分類及種質(zhì)遺傳多樣性分析提供技術(shù)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：蘭屬；品種；AFLP；遺傳多樣性

中圖分類號：S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 論文編號：2014-0113

Abstract： The aim was to analyze genetic diversity of Cybidium and establish suitable reaction system from the molecular level. The genetic diversity and relationship of 9 cultivars of Cymbidium were evaluated using AFLP molecular markers in this study. Among the 965 AFLP bands obtained from eight selective primer pairs， 931 （95.87%） were polymorphic. The average number of DNA bands per primer pair was 121，and the average number of DNA polymorphic bands per primer pair was 116. Using NTSYS2·10 to UPGMA cluster analysis， cultivars originated from the same species could be clustered together in the AFLP dendrogram and this division was in consistence with the morphological classification. Genetic similarity among the cultivars ranged from 0.416 to 0.606. The reaction system of AFLP could be used to the classifying of Cybidium and the analysis of its germplasm genetic diversity.

Key words： Cybidium； Cultivar； AFLP； Genetic Diversity

0 引言

蘭屬（Cymbidium）是蘭科的樹蘭亞科的一個(gè)屬，全世界約有蘭屬植物55種，主要分布于亞洲熱帶與亞熱帶地區(qū)，向南到新幾內(nèi)亞島和澳大利亞。中國有49種蘭屬植物和一些變種，產(chǎn)于秦嶺以南各省[1]，中國人傳統(tǒng)上所說的蘭花，大都是指蘭科蘭屬中的地生蘭類植物，具有重要的藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值[2-3]。

傳統(tǒng)的蘭屬植物分類和品種鑒定常常以花和葉的形態(tài)特征為依據(jù)，結(jié)果往往受到生長環(huán)境和發(fā)育階段的限制。由于各種變種以及自然雜交種的存在，僅憑植株的形態(tài)特征進(jìn)行蘭花種質(zhì)鑒定較為困難，這對蘭花品種研究產(chǎn)生了不利影響。DNA分子標(biāo)記技術(shù)以遺傳物質(zhì)為依據(jù)，從基因水平直接反映種間和種內(nèi)差異，突破以往用傳統(tǒng)方法分類鑒定的局限性，直接在物種基因組DNA水平上顯示遺傳多樣性，為分類鑒定提供了高效準(zhǔn)確的方法。

AFLP是新發(fā)展起來的一項(xiàng)檢測DNA多態(tài)性技術(shù)，它從原理上結(jié)合了RFLP和RAPD的優(yōu)點(diǎn)，具有高分辨率、高重復(fù)性、高靈敏度和共顯性等特點(diǎn)，通過對基因組DNA的限制性酶切片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增而揭示多態(tài)性[4-5]。AFLP標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)在DNA指紋圖譜繪制、品種鑒定、遺傳多樣性分析及基因定位等方面得到了廣泛應(yīng)用[6]。目前，已用于蘭屬植物的分子標(biāo)記技術(shù)有RAPD[7-9]、ISSR[10-12]和SRAP[13-14]，利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對蘭屬植物遺傳多樣性研究較少且技術(shù)體系存在差異[6，15]，本實(shí)驗(yàn)以9個(gè)蘭屬品種為研究材料，利用AFLP技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性分析，擬建立適合蘭屬植物的AFLP分子標(biāo)記反應(yīng)體系，為蘭屬植物遺傳多樣性研究及新種的選育提供分子水平的技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試材料為蘭屬（蓮瓣蘭、建蘭、春蘭和春劍）的9個(gè)品種（表1），由泰安市泰山林業(yè)科學(xué)研究院蘭花種質(zhì)資源圃提供。

1.2.5 凝膠分析 選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物和上樣緩沖液比例為8：3，渦旋混勻，95℃變性，8 min后，立即冰浴，取4 μL上樣到ABI377測序儀，進(jìn)行4%聚丙烯酰胺凝膠電泳，室溫下電泳2.4 h，自動(dòng)采集原始膠圖。對照（Marker）為ROX500分子量內(nèi)標(biāo)。電泳結(jié)束后用Genescan3.1從原始膠圖中提取數(shù)據(jù)，然后用Binthere將片段的大小提取出來，再用Excel將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成0和1數(shù)據(jù)，用Popgene和Ntsys2·10進(jìn)行多態(tài)性和聚類分析。用Max comp程序?qū)垲惤Y(jié)果和相似系數(shù)矩陣之間的相關(guān)性進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選和多態(tài)性分析

通過對64對AFLP引物的篩選，篩選出了8對多態(tài)性較強(qiáng)且擴(kuò)增產(chǎn)物清晰的引物組合（表2）。8對引物共擴(kuò)增條帶965條，其中多態(tài)性帶931條；平均1對引物擴(kuò)增條帶121條，其中多態(tài)性帶116條，多態(tài)百分比為95.87%。8對引物組合均能揭示DNA多態(tài)性，其中引物HindIIIAAC/MseI CTC擴(kuò)增出多態(tài)性條帶最少為100條，多態(tài)性比例為98.04%，HindIIIAGC/MseI CTC擴(kuò)增的多態(tài)性帶最多為132條，多態(tài)性比例為97.06%，表明蘭屬植物具有豐富的遺傳多態(tài)性。

2.2 凝膠分析

AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物長度介于70～500 bp之間，其中引物HindIIIAGC/MseI CTT的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果見圖1，結(jié)果條帶清晰，該引物共擴(kuò)增出132條帶，其中多態(tài)性帶125條，占94.7%，說明上述體系可用于蘭屬植物的AFLP分析。

2.3 聚類分析

基于AFLP的擴(kuò)增結(jié)果，用NTSYS2·10進(jìn)行UPGMA聚類分析，得到蘭屬植物品種親緣關(guān)系樹狀圖（圖2）。將聚類結(jié)果進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)為0.8219，達(dá)到極顯著水平，表明聚類結(jié)果很好地體現(xiàn)了蘭屬植物品種間的親緣關(guān)系。由AFLP技術(shù)得到的聚類圖將9個(gè)品種共分為4個(gè)部分，屬于同種的品種聚在一起，與表型分類基本吻合，如春蘭品種集圓、萬字和宋梅聚在一起，建蘭品種地荷、神童冠、小天龍和綠梅也聚在一起。聚類結(jié)果表明AFLP技術(shù)可將種內(nèi)的品種完全區(qū)分開。總之此技術(shù)體系可以很好地揭示供試蘭屬植物種間和種內(nèi)的遺傳差異和親緣關(guān)系。

9個(gè)品種間遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.416～0.606?！√忑埡汀G梅間相似系數(shù)最高，為0.606，說明具較高的同源性?！尚退嘏c其他供試品種的遺傳相似系數(shù)都較小，與‘萬字的相似系數(shù)最小，為0.416，說明‘荷型素與‘萬字間的遺傳距離較遠(yuǎn)。

3 結(jié)論與討論

前人利用AFLP技術(shù)對蘭屬植物進(jìn)行遺傳多樣性研究的酶切體系均采用EcoRI/MseI[6，16-17]和PstI/MseI[15]，而本實(shí)驗(yàn)條件下，HindIII/MseI體系能夠得到清晰、穩(wěn)定和多態(tài)性豐富的指紋圖譜，DNA分子水平上的多態(tài)性可對蘭屬植物進(jìn)行遺傳多樣性分析，通過聚類分析可區(qū)分蘭屬植物，完善和補(bǔ)充了蘭屬植物分子標(biāo)記反應(yīng)體系，是一種適于蘭屬親緣關(guān)系及遺傳多樣性分析的方法。

謝偉等[7]和梁紅健等[18]認(rèn)為蓮瓣蘭與春蘭、建蘭是平行關(guān)系，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蓮瓣蘭品種與春蘭品種的親緣關(guān)系較近，這與陳心啟等[2]和孫彩云等[19]的研究結(jié)果基本相符；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明春劍品種和春蘭品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與吳應(yīng)祥[20]觀點(diǎn)一致，而陳心啟等[2]認(rèn)為春劍是春蘭的一個(gè)變種?？傊?，蘭屬種間和種內(nèi)分類存在分歧，有待進(jìn)一步深入研究，對蘭屬種質(zhì)資源保護(hù)與新品種開發(fā)都有重要意義。

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