王澤彬，傅君舟，周姍姍

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 廣州 510260；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 廣州 510182）

血管緊張素Ⅱ及氯沙坦對(duì)小鼠足細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4表達(dá)的影響

王澤彬1，傅君舟2，周姍姍2

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 廣州 510260；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 廣州 510182）

目的觀察血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)對(duì)足細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)表達(dá)的影響，及血管緊張素1型受體阻斷劑氯沙坦(Losartan，Lo)能否抑制AngII對(duì)足細(xì)胞GLUT4的作用。方法將小鼠MPC5足細(xì)胞分成對(duì)照組、AngⅡ10-6mmol/L組、AngⅡ10-8mmol/L組、AngⅡ10-10mmol/L組、Lo10-6mmol/L+AngⅡ10-6mmol/L組，半定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)足細(xì)胞GLUT4mRNA的水平，間接免疫熒光檢測(cè)GLUT4蛋白的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比，AngⅡ10-6mmol/L組能夠顯著抑制GLUT4的表達(dá)及蛋白合成，GLUT4 mRNA的表達(dá)下降了56.1%(P=0.041)，間接免疫熒光表達(dá)下降了54.9%(P＜0.05)。AngⅡ10-8mmol/L組及AngⅡ10-10mmol/L組GLUT4的表達(dá)與對(duì)照組相比有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，AngⅡ10-8mmol/L組對(duì)GLUT4抑制強(qiáng)于AngⅡ10-10mmol/L組，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Lo 10-6mmol/L+AngⅡ10-6mmol/L組GLUT4的表達(dá)顯著升高，與AngⅡ10-6組相比，mRNA升高176.3%(P=0.006)，蛋白表達(dá)升高87.8%(P＜0.05)。結(jié)論AngⅡ能夠顯著抑制足細(xì)胞GLUT4的表達(dá)及合成，具有濃度依賴性，這種作用能被氯沙坦所阻斷。

血管緊張素Ⅱ；氯沙坦；足細(xì)胞；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4

足細(xì)胞是構(gòu)成腎小球三層濾過屏障的最后一道屏障，通過足突間的nephrin等分子結(jié)構(gòu)將相鄰的足細(xì)胞緊密鉚合在一起，阻止白蛋白等大分子物質(zhì)的濾出。足細(xì)胞是胰島素敏感細(xì)胞[1]，能夠通過表達(dá)GLUT1及GLUT4從而快速轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖，為足細(xì)胞的調(diào)節(jié)提供能量，維持腎小球?yàn)V過屏障的完整。AngⅡ已經(jīng)被證明能夠通過多種途徑導(dǎo)致腎臟損傷，目前仍無實(shí)驗(yàn)證明AngⅡ是否對(duì)足細(xì)胞GLUT4的表達(dá)具有影響，從而導(dǎo)致濾過屏障的損傷。本實(shí)驗(yàn)通過AngⅡ?qū)w外小鼠足細(xì)胞GLUT4的影響，探討AngⅡ在腎臟損傷中的新機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、Ⅰ型膠原(美國(guó)Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，γ-干擾素(PEPROTECH INC)RNA提取試劑盒、Taq Platinum PCR MasterMix(TIANGEN)，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)。

1.2 足細(xì)胞的來源及分組 小鼠MPC5足細(xì)胞株由美國(guó)Mundel教授惠贈(zèng)，北京大學(xué)第一醫(yī)院丁潔教授轉(zhuǎn)贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)所用的足胞為13～14代。分組：將足細(xì)胞分為正常對(duì)照組、AngⅡ10-6mol/L組、AngⅡ10-8mol/L組、AngⅡ10-10mol/L組及Lo10-6+AngⅡ10-6組。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%(體積分?jǐn)?shù))的胎牛血清，20 μ/ml γ-干擾素的1640培養(yǎng)液，在33℃的培養(yǎng)箱(5%的CO2)中培養(yǎng)傳代，然后細(xì)胞轉(zhuǎn)入不含γ-干擾素的10%胎牛血清1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)8～10 d，使足細(xì)胞成熟分化。待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶約80%，換無血清培養(yǎng)液孵育24 h，使細(xì)胞同步于G0期，按分組計(jì)劃加入各組刺激藥物培養(yǎng)液，作用4 h，每組設(shè)三復(fù)瓶。

1.4 總RNA的提取 用TIANGEN總RNA提取試劑盒，按說明書操作，提取各組細(xì)胞的總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)260 mm的紫外吸收值，根據(jù)OD260的值計(jì)算RNA的濃度。

1.5 GLUT4 mRNA的檢測(cè) 引物合成：用Prime Primer5.0軟件設(shè)計(jì)GLUT4寡核甘酸引物：正義鏈 5'-TGTTGCGGATGCTATGGG-3'，反義鏈5'-CAGGGGGAATGAGGGGTA-3'，長(zhǎng)度為376 bp。按文獻(xiàn)[3]合成GADPH引物：正義鏈5'-CTCATGACCACAGTCCATGC-3'，反義鏈5'-CACATTGGGGGTAGGAACACcDNA-3'長(zhǎng)度為201 bp。RT-PCR：取各組細(xì)胞5 μg的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行PCR，反應(yīng)，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，29次循環(huán)，72℃延伸5 min，取5 μl的PCR產(chǎn)物于2%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，紫外燈下凝膠成像系統(tǒng)成像，用Image-J圖像分析處理系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析，待測(cè)指標(biāo)與GADPH的灰度比值表示其相對(duì)含量。

1.6 間接免疫熒光染色檢測(cè)GLUT4蛋白表達(dá) 間接免疫熒光染色：取出各組玻片，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，95%的乙醇固定30 min，0.1%Triton X-100室溫透化10 min，BSA封閉。滴加一抗(兔抗鼠GLUT4抗體，SANTA公司)，4℃過夜，PBS沖洗，滴加二抗(TRITC標(biāo)記的羊抗兔抗體，中杉金橋)，室溫2 h，防熒光衰減液封片，用熒光顯微鏡觀察和記錄各組足細(xì)胞GLUT4的蛋白表達(dá)。用Image Pro Plus 5.0圖象分析系統(tǒng)測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，方差齊性的兩均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AngⅡ及氯沙坦對(duì)足細(xì)胞GLUT4 mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較AngⅡ10-10mmol/L、AngⅡ10-8mmol/L、AngⅡ10-6mmol/L能夠降低足細(xì)胞GLUT4 mRNA的表達(dá)，隨著AngⅡ濃度增加，GLUT4 mRNA的表達(dá)逐漸下降。但AngⅡ10-10mmol/L組、AngⅡ10-8mmol/L組與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AngⅡ10-6mmol/L能夠顯著抑制GLUT4 mRNA的表達(dá)(P＜0.05)，見圖1和表1。因此，本實(shí)驗(yàn)選取AngⅡ10-6mmol/L組作為氯沙坦的干預(yù)組，先用氯沙坦10-6mmol/L作用于足細(xì)胞，再加入AngⅡ10-6mmol/L，在 Lo10-6+AngⅡ 10-6mmol/L組，GLUT4 mRNA的表達(dá)顯著高于AngⅡ10-6mmol/L組(P＜0.05)，見圖1和表1?；謴?fù)到對(duì)照組的水平，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 各組GLUT4mRNA的表達(dá)

2.2 AngⅡ及氯沙坦對(duì)足細(xì)胞GLUT4蛋白表達(dá)的影響 在間接免疫熒光中，與對(duì)照組比較，AngⅡ 10-10mmol/L、AngⅡ10-8mmol/L、AngⅡ10-6mmol/L能夠降低足細(xì)胞GLUT4蛋白的表達(dá)，隨著AngⅡ濃度增加，GLUT4蛋白的表達(dá)逐漸下降。但AngⅡ10-10mmol/L組、AngⅡ10-8mmol/L組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AngⅡ10-6mmol/L能夠顯著抑制GLUT4蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，見圖2和表2。因此，本實(shí)驗(yàn)選取AngⅡ10-6mmol/L組作為氯沙坦的干預(yù)組，先用氯沙坦10-6mmol/L作用于足細(xì)胞，再加入AngⅡ10-6mmol/L，在Lo10-6+AngⅡ10-6mmol/L組，GLUT4蛋白的表達(dá)顯著高于AngⅡ10-6mmol/L組(P＜0.05)，見圖2和表2?；謴?fù)到對(duì)照組的水平，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組GLUT4 mRNA的表達(dá)(，mmol/L)

表1 各組GLUT4 mRNA的表達(dá)(，mmol/L)

注：a與CON組比較，P＜0.05；b與Lo10-6+AngⅡ10-6比較，P＜0.05。

組別CON組AngⅡ10-6組AngⅡ10-8組AngⅡ10-10組Lo10-6+AngⅡ10-6組孔數(shù)33333 GLUT4 mRNA 0.212±0.109 0.093±0.041ab0.184±0.085 0.192±0.077 0.257±0.229

圖2 各組GLUT4免疫熒光表達(dá)

表2 各組GLUT4蛋白的表達(dá)(，mmol/L)

表2 各組GLUT4蛋白的表達(dá)(，mmol/L)

注：a與CON組比較，P＜0.05；b與Lo10-6+AngⅡ10-6組比較，P＜0.05。

組別Con AngⅡ10-6AngⅡ10-8AngⅡ10-10Lo10-6+AngⅡ10-6孔數(shù)33333 GLUT1 mRNA 28.04±10.82 12.64±4.68ab23.59±9.25 24.39±8.06 23.75±6.13

3 討 論

血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)能夠通過多種途徑損傷腎臟，其中有血流動(dòng)力學(xué)的因素[2]，例如引起腎血管收縮，導(dǎo)致腎臟缺血，腎小球率過濾下降，造成缺血性損傷；也有非血流動(dòng)力學(xué)的因素[3]，AngⅡ能夠通過刺激轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)的合成導(dǎo)致腎小球系膜基質(zhì)大量增生，而且能夠通過血管緊張素Ⅱ2型受體作用，導(dǎo)致小鼠腎小球上皮細(xì)胞凋亡脫落[4]，從而引起腎小球硬化。足細(xì)胞是高度分化的終末細(xì)胞，通過足突相互嵌合并粘附于基底膜，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞病變是某些先天性腎病綜合征及腎病綜合征早期蛋白尿產(chǎn)生的重要原因[5-6]，在1型及2型糖尿病腎病早期[7-8]，即出現(xiàn)足細(xì)胞功能異常及脫落。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)是哺乳類動(dòng)物攝取葡萄糖并加以利用的重要分子[9]，目前發(fā)現(xiàn)人類足細(xì)胞中有GLUT1及GLUT4的表達(dá)[1]，在足細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖中起到重要作用，其功能異常可能是足細(xì)胞胰島素抵抗的重要原因，是糖尿病早期蛋白尿產(chǎn)生的重要因素。本文通過AngⅡ?qū)ψ慵?xì)胞GLUT4的影響，探討AngⅡ在糖尿病腎病中可能起到的病理生理作用，為糖尿病腎病的早期診斷治療提供一定的理論依據(jù)。

本研究中，體外培養(yǎng)的足細(xì)胞在AngⅡ的刺激下GLUT4的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)明顯降低，AngⅡ10-6mmol/L的刺激濃度與對(duì)照組比較，GLUT4 mRNA的表達(dá)下降了56.1%(P＜0.05)，蛋白表達(dá)下降了54.9%(P＜0.05)；AngⅡ10-10mmol/L、AngⅡ10-8mmol/L濃度刺激下，GLUT4表達(dá)與對(duì)照組比較，雖然差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但仍有明顯的下降趨勢(shì)，隨著濃度的增加，GLUT4的表達(dá)越受到抑制，這說明AngⅡ?qū)LUT4的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的抑制作用呈劑量依賴性。在足細(xì)胞用血管緊張素1型受體(AT1)阻斷劑氯沙坦(Lo)作用后，再用AngⅡ刺激足細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)GLUT4的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)與AngⅡ10-6mmol/L比較，分別升高了176.3% (P=0.006)及87.8%(P＜0.05)，說明AngⅡ通過其1型受體對(duì)足細(xì)胞進(jìn)行作用，AT1受體阻斷劑能在受體水平阻斷這種作用。與骨骼肌一樣，足細(xì)胞也能通過GLUT1及GLUT4將組織間液中的葡萄糖快速轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)，為細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)調(diào)整提供能量，足細(xì)胞作為腎小球?yàn)V過屏障的最后一層結(jié)構(gòu)，需要不斷地調(diào)整自身結(jié)構(gòu)維持屏障的完整，這需要通過細(xì)胞骨架的構(gòu)型變換完成[10]，足細(xì)胞通過GLUT1、GLUT4吸取葡萄糖為這種調(diào)整提供能量。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞能夠表達(dá)AT1受體[11]，為AngⅡ作用于足細(xì)胞提供條件，從而引起GLUT4的表達(dá)下降，引起足細(xì)胞的胰島素抵抗，造成腎小球?yàn)V過屏障的損傷，從而導(dǎo)致蛋白尿的生成。但目前最新的研究[12]表明，小鼠足細(xì)胞還能夠表達(dá)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)，能夠降解AngⅡ?yàn)锳ng1-7，對(duì)足細(xì)胞有保護(hù)作用。因此，AngⅡ?qū)ψ慵?xì)胞的具體作用還需要更多的實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

本研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ能夠從轉(zhuǎn)錄水平及蛋白合成水平阻止足細(xì)胞GLUT4的合成，這種作用能夠被血管緊張素受體1阻斷劑氯沙坦所阻斷，證明的AngⅡ是通過AT1受體發(fā)揮作用，導(dǎo)致足細(xì)胞的損傷，并且這種作用具有濃度依賴性。足細(xì)胞GLUT4的表達(dá)下降可能與足細(xì)胞的胰島素抵抗有關(guān)，從而引起濾過屏障的損傷，導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生。

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Influence of angiotensinⅡand losartan on GLUT4 expression in cultured mouse podocyte cells.

WANG Ze-bin1,FU Jun-zhou2,ZHOU Shan-shan2.

1.Nephrology Department,Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510260,Guangdong,CHINA;2.Nephrology Department,Guangzhou First People's Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University,Guangzhou 510182,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the influence of angiotensinⅡ(AngⅡ)on the expression of GLUT4 and whether losartan(Lo)could depress the function of AngⅡon podocytes.MethodsThe mouse podocyte clone 5 (MPC5)were divided into five groups:the control group,AngⅡ at the concentration of 10-6,10-8,10-10mmol/L groups,and Lo 10-6mmol/L+AngⅡ10-6mmol/L group.The GLUT4 mRNA level was detected by semi-quantitativeRT-PCR and the expression of GLUT4 by indirect immunofluorescence.ResultsCompared to the control group,in group AngⅡ10-6mmol/L,the GLUT4 expression and protein synthesis were significantly decreased,GLUT4 mRNA transcription was decreased by 56.1%(P=0.041),and indirect immunofluorescence expression was decreased by 54.9%. The GLUT4 expression of AngⅡ10-10mmol/L and AngⅡ10-8mmol/L group was decreased compared with the control group,but there were no statistically significant difference.AngⅡ10-8mmol/L depressed more GLUT4 expression than the AngⅡ10-10mmol/L did,and there were also no statistically significant difference(P＞0.05).As for the Lo 10-6mmol/L+ AngⅡ10-6mmol/L group,the GLUT4 expression was significantly increased,when compared with the AngⅡ10-6group its GLUT4 mRNA transcription was increased by 176.3%(P=0.006),and indirect immunofluorescence expression increased by 87.8%(P＜0.05).ConclusionAngⅡcould significantly decrease the GLUT4 expression and synthesis,and the effect was concentration dependent therefore could be hampered by Losartan.

AngiotensinⅡ;Losartan;Podocyte;Glucose transporter 4

R-332

A

1003—6350（2014）24—3592—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.24.1404

2014-06-08)