羅海清，黃 靜，楊東紅，陳梓宏，余忠華

（廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤中心二區(qū)，廣東 湛江 524001）

FHIT基因和蛋白在鼻咽癌組織及正常鼻咽組織中的表達(dá)

羅海清，黃 靜，楊東紅，陳梓宏，余忠華

（廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤中心二區(qū)，廣東 湛江 524001）

目的研究FHIT基因和蛋白在鼻咽癌組織以及正常鼻咽組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法采用實時熒光定量PCR(RQ-RT-PCR)方法和免疫組織化學(xué)染色法分析檢測54例鼻咽癌組織和28例正常鼻咽組織FHIT基因和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果鼻咽癌組織中FHIT基因和蛋白的表達(dá)顯著低于正常鼻咽組織（P＜0.050），且FHIT基因和蛋白的表達(dá)與病理分化程度、臨床分期密切相關(guān)(P＜0.05)，與患者的年齡、性別、癌組織的浸潤深度無關(guān)(P＞0.05)。結(jié)論FHIT基因和蛋白可能有助于鼻咽癌的診斷，它可作為鼻咽癌的預(yù)后因子。

FHIT；鼻咽癌；基因；蛋白；表達(dá)

鼻咽癌是目前中國南方地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一。世界衛(wèi)生組織調(diào)查報道，全球有80%的鼻咽癌患者在中國。中國鼻咽癌每年的發(fā)病率為30/10萬～50/10萬，男性發(fā)病率是女性的三倍。由于大多數(shù)鼻咽癌確診時已是晚期，因此研究鼻咽癌的分子標(biāo)志物對于鼻咽癌的早期診斷和治療具有重要的意義。FHIT基因是1996年由Ohta等發(fā)現(xiàn)的一個抑癌基因，它位于位于染色體3p14.2，含10個外顯子。幾乎在所有組織都可以檢測到FHIT基因的表達(dá)，包括：肺、乳腺、腦、肝臟、腎臟、前列腺、宮頸、卵巢等。研究發(fā)現(xiàn)FHIT蛋白的過度表達(dá)，可引起腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤的發(fā)生[1]。FHIT基因的失活或缺失可導(dǎo)致乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、宮頸癌的發(fā)生，但它與鼻咽癌的發(fā)生關(guān)系確少見報道。本研究采用RQ-RT-PCR方法和免疫組織化學(xué)染色法檢測54例鼻咽癌組織和28例鼻咽正常組織中FHIT基因和FHIT蛋白的表達(dá)水平，并分析其與各臨床病理特征的相關(guān)性，以探討FHIT基因及其蛋白在鼻咽癌的診斷及預(yù)后判斷中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤中心二區(qū)2011年1月至2013年8月通過鼻內(nèi)鏡活檢病理確診的鼻咽癌組織54例和鼻咽正常組織28例。進(jìn)行RQ-RT-PCR檢測的標(biāo)本貯存于液氮中以便抽提mRNA。另外進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色法的標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。所有患者均簽署知情同意書，臨床分期采用2008年鼻咽癌分期標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 總RNA的提取 將組織在研磨液磨成粉末后，在每50～100 mg組織中加入1 ml Trizol液研磨，研磨液室溫放置5 min，然后以每1 ml Trizol液加入0.2 ml的比例加入氯仿，劇烈搖蕩離心管15 s。吸取上清至一新的離心管，按每1 ml Trizol液加0.5 ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10 min，12 000×g離心10 min。棄去上清液，按每1 ml Trizol液加入1 ml 75%乙醇的比例加入75%乙醇，混勻，4℃下7 500×g離心5 min。棄去上清液，然后室溫或真空干燥5～10 min。用DEPC水溶解RNA，用紫外分光光度計計量后置于-70oC編號存放。

1.3 RQ-RT-PCR分析方法 抽提的總RNA進(jìn)行鑒定后，按Primescript RT Reagent Kit說明進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄。取RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)按SYBRPreminxExTaqIIKit說明進(jìn)行操作，引物由北京生物試劑公司設(shè)計并合成：FHIT正向引物：5'-CAACATCTCATCAAGCCCTCT-3'，反向引物：5'-TCCACCACTGTCCCGACT-3'，擴增產(chǎn)物為219bp；β-actin(內(nèi)參)正向引物：5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，反向引物：5'-CTAAG TCATAGTC CGCC TAGAAGCA-3'，擴增產(chǎn)物為186 bp。RT-PCR反應(yīng)在ABI7300實時定量PCR儀上完成，并選用ddCt相對定量法分析各目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)量。其反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為95°C預(yù)變性2 min，95°C變性5 s，60°C延伸31 s，40個循環(huán)。

1.4 免疫組織化學(xué)染色法

1.4.1 試劑 濃縮型兔抗人FHIT多克隆抗體購自上海朗怡生物技術(shù)有限公司，SP試劑盒及DAB顯色液均購自上海朗怡生物技術(shù)有限公司。

1.4.2 免疫組織化學(xué)染色法 采用免疫組化SP法檢測組織中FHIT蛋白的表達(dá)。本試驗采用EnVision二步法進(jìn)行。步驟如下：切片脫蠟至水；0.3%H2O2甲醇處理切片10 min；水洗；抗原修復(fù)；磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次1 min；加入一抗體孵育30～60 min；PBS洗3次，每次2 min；加入增強劑孵育20～30 min；PBS洗3次，每次2 min；加入酶標(biāo)抗兔/鼠，復(fù)合物，孵育20～30 min；PBS洗3次，每次2 min；DAB-H2O2孵育5～10 min；PBS洗，水洗；Harris蘇木素染核5～10 min；水洗，分化，藍(lán)化，脫水，透明并封固。用已知陽性鼻咽癌組織切片作陽性對照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判斷：FHIT陽性表達(dá)在胞漿。FHIT的表達(dá)以細(xì)胞染色強度和細(xì)胞陽性百分比之和進(jìn)行判斷。先按染色強度打分，選擇5個高倍鏡視野(400×)來進(jìn)行判斷：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為黃褐色，染色強度需與染色背景相對比，再按陽性細(xì)胞百分比打分，0分為0～5%，1分為6%～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為75%以上。上述兩項之和，0分為陰性，1～2分為弱陽性，3～4分為中度陽性，5～6分為強陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料 54例鼻咽癌患者中男性29例，女性25例，患者年齡30～67歲，中位年齡46歲，其中高中分化癌35例，未分化、低分化癌19例。在28例鼻咽正常組織的對照者中有男性19例，女性9例，患者年齡27～66歲，中位年齡45歲。

2.2 FHIT基因的表達(dá) 54例鼻咽癌組織中12例FHIT基因表達(dá)陽性(22.2%)，28例鼻咽正常組織中21例FHIT基因表達(dá)陽性(75.0%)，F(xiàn)HIT基因的表達(dá)水平在鼻咽癌組織中顯著低于正常鼻咽組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.219 5，P＜0.05)。

2.3 FHIT基因的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 依據(jù)鼻咽癌患者的年齡、性別、病理分化程度、癌組織的浸潤深度、臨床分期等情況進(jìn)行分類統(tǒng)計。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)FHIT基因的表達(dá)水平與病理分化程度、臨床分期密切相關(guān)(χ2=9.073 7，P＜0.05；χ2=8.141 5，P＜0.05)，與患者的年齡、性別和癌組織的浸潤深度無關(guān)(χ2=0.018 3，P＞0.05；χ2=3.218 8，P＞0.05；χ2=0.000 0，P＞0.05)，見表1。

表1 鼻咽癌組織中FHIT基因的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系(例)

2.4 FHIT蛋白的表達(dá) 無論鼻咽癌組織還是正常鼻咽組織，F(xiàn)HIT蛋白主要在細(xì)胞漿中表達(dá)，少見于細(xì)胞核。54例鼻咽癌組織中FHIT蛋白陽性表達(dá)的15例(27.8%)，28例鼻咽正常組織中FHIT蛋白陽性表達(dá)的18例(64.2%)。結(jié)果表明鼻咽癌組織中FHIT蛋白的表達(dá)顯著地低于正常鼻咽組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.219 5，P＜0.05)。

2.5 鼻咽癌組織中FHIT蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 研究結(jié)果顯示，F(xiàn)HIT蛋白的表達(dá)水平與病理分化程度、臨床分期密切相關(guān)(χ2=7.407 0，P＜0.05；χ2=5.026 2，P＜0.05)，與患者的年齡、性別、癌組織的浸潤深度無關(guān)(χ2=0.018 3，P＞0.05；χ2=0.331 2，P＞0.05；χ2=0.415 4，P＞0.05)，見表2。

表2 鼻咽癌組織中FHIT蛋白的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系(例)

3 討 論

抑癌基因的失活或缺失在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的作用。脆性位點是染色體在特殊條件下易斷裂的非隨意位點。研究表明DNA的不穩(wěn)定脆性位點可能影響功能基因在染色體區(qū)域的定位，并與惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)聯(lián)[2]。FHIT基因位于人類普通型染色體脆性位點FRA3B，是1996年由Ohta等發(fā)現(xiàn)的一個抑癌基因。研究證實FHIT基因的失活或者缺失是眾多腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個重要步驟，其中包括肺癌、卵巢癌、胃癌等[3-5]。此外，研究還報道了FHIT基因表達(dá)的失活或缺失與多種臨床分期偏晚期、病理分化程度較差的腫瘤的臨床病理特征相關(guān)聯(lián)，包括：乳腺癌、宮頸癌等[6-7]。目前有關(guān)FHIT在鼻咽癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性尚未見報道。因此我們進(jìn)行了相關(guān)的研究。

本研究中我們分析了FHIT基因和蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性。研究結(jié)果顯示FHIT基因及其蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)均顯著地低于正常鼻咽組織，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。提示FHIT基因及其蛋白的表達(dá)下調(diào)或者缺失可能在鼻咽癌的發(fā)生中起著重要的作用。另外研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HIT基因及其蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)與患者的年齡、性別、癌組織的浸潤深度無關(guān)，與病理分化程度、臨床分期密切相關(guān)。結(jié)果顯示FHIT基因顯著地低表達(dá)在病理分化程度較差(低未分化vs高中分化，χ2=5.991，P＜0.05)、臨床分期偏晚期(Ⅲ～Ⅳ期vsⅠ～Ⅱ期，χ2=8.763，P＜0.05)的鼻咽癌組織中，結(jié)果同時顯示FHIT蛋白也顯著地低表達(dá)在病理分化程度較差(低未分化vs高中分化，χ2=18.567，P＜0.05)、臨床分期偏晚期(Ⅲ～Ⅳ期vsⅠ～Ⅱ期，χ2=6.657，P＜0.05)的鼻咽癌組織中。已有研究報道FHIT基因的失活或缺失在病理分化程度較差和臨床分期較晚期的乳腺癌[6]，非小細(xì)胞肺癌[4]組織中更為明顯，這與我們的研究結(jié)果相似。因此我們推測FHIT基因與鼻咽癌的發(fā)生有關(guān)，其表達(dá)的下調(diào)或者缺失可促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)生，且鼻咽癌惡性程度越高，F(xiàn)HIT基因及其蛋白的表達(dá)缺失率越高。

總之，本研究提示FHIT基因及其蛋白可能作為鼻咽癌一個重要標(biāo)志物，它的失活或缺失在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著一定的作用。檢測FHIT基因及其蛋白將為鼻咽癌的診斷、預(yù)后的判斷提供重要的依據(jù)。

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Expression of FHIT gene and its protein in nasopharyngeal carcinoma tissues and normal nasopharyngealtissues.

LUO Hai-qing,HUANG Jing,YANG Dong-hong,CHEN Zi-hong,YU Zhong-hua.

Oncology Center,AffiliatedHospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang 524001,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of FHIT gene and its protein in nasopharyngeal carcinoma tissues and normal nasopharyngeal tissues,and explore its clinical significance.MethodsThe expression of FHIT gene and its protein was assessed by RQ-RT-PCR and immunohistochemical staining in 54 nasopharyngeal carcinoma and 28 normal nasopharyngeal tissues.ResultsThe expression of FHIT gene was significantly lower in nasopharyngeal carcinoma tissues than that in normal nasopharyngeal tissues(P＜0.05).The expression of FHIT gene and its protein was closely related to differentiation and clinical stage(P＜0.05)and not related to age,gender and tumor invasion depth(P＞0.05).ConclusionFHIT gene and its protein may contribute to clinical diagnosis of nasopharyngeal carcinoma,and it may be a prognostic factor for nasopharyngeal carcinoma.

FHIT;Nasopharyngeal cancer;Gene;Protein;Expression

R739.63

A

1003—6350（2014）24—3640—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.24.1419

2014-04-24)

余忠華。E-mail：zhanghua_yu@126.com