陳廣順,司中洲,李杰群,李 亭,齊海智
(中南大學(xué)湘雅第二醫(yī)院普外科,湖南長(zhǎng)沙 410011)
肝臟移植術(shù)和肝臟部分切除術(shù)通常需要阻斷肝門而發(fā)生肝臟缺血再灌注損傷,加重其功能代謝障礙及組織結(jié)構(gòu)破壞,合適的免疫抑制方案可有效降低排斥反應(yīng)的發(fā)生[1-2]。雷帕霉素(rapamycin, RAPA)是一種新型大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑,具有抗增殖、抗腫瘤及無(wú)腎毒性等特性,近年來(lái)逐漸應(yīng)用于肝移植患者或其他器官移植的患者,獲得了防治肝移植術(shù)后腎功能不全、慢性排斥反應(yīng)和提高移植物長(zhǎng)期存活的新途徑[3-4]。本實(shí)驗(yàn)采用肝臟缺血再灌注模型,研究雷帕霉素對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷肝臟功能的影響和肝組織的病理學(xué)變化, 探討雷帕霉素對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的減輕作用及對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)功能。
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康清潔型SD雄性大鼠54只,體質(zhì)量200~250 g,購(gòu)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后用于試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分3組:假手術(shù)組、手術(shù)組和雷帕霉素組,再灌注后以2、6、24 h為觀察時(shí)相,每個(gè)觀察時(shí)相6只。
1.2動(dòng)物模型的建立[5-6]術(shù)前12 h禁食,自由飲水,腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥麻醉后打開(kāi)腹腔,暴露肝臟,分離顯露肝門部,剪左中肝葉各韌帶,游離左、中肝葉的膽管及門靜脈、肝動(dòng)脈分支。用血管夾鉗夾后造成左、中葉肝臟缺血, 麻醉后用無(wú)損傷小血管夾阻斷大鼠左半肝血供90 min,阻斷后可見(jiàn)被阻斷區(qū)肝葉顏色由鮮紅色變?yōu)榘导t色表明肝臟缺血成功,恢復(fù)血流進(jìn)行再灌注60 min,形成肝缺血再灌注模型。假手術(shù)組僅行麻醉剖腹,解剖肝門,不行血供阻斷;雷帕霉素組在肝臟缺血前5 min經(jīng)腸系膜上靜脈緩注5 mg/kg雷帕霉素,假手術(shù)組和手術(shù)組用同等劑量生理鹽水。各組均于再灌注2、6、24 h后,取大鼠外周血血清檢測(cè)肝臟功能的變化,并取缺血肝葉標(biāo)本,固定于甲醛溶液用于病理學(xué)檢測(cè)。
1.3檢測(cè)指標(biāo)及方法血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT),天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的含量用常規(guī)生化方法測(cè)定;采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定血漿SOD超氧化物歧化酶(SOD)活力;硫代巴比妥酸顯色法檢測(cè)丙二醛(MDA);ELISA 檢測(cè)血漿TNF-α和IL-1;SOD、MDA測(cè)試盒由南京建成生物工程研究所出品。肝組織病理學(xué)處理和觀察:用1∶10的甲醛溶液固定新鮮肝組織, 按病理學(xué)常規(guī)制片,HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察。
2.1血清ALT和AST水平的比較手術(shù)組和雷帕霉素組不同時(shí)段ALT和AST均高于假手術(shù)組,差異具有顯著性(P<0.05);手術(shù)組24 h的ALT和AST分別為(377.48±35.65)IU/L和(1 106.74±102.57)IU/L,高于2 h和6 h(P<0.05);6 h的ALT和AST分別為(258.47±25.61)IU/L和(936.58±87.60)IU/L,均高于2 h(P<0.05);雷帕霉素組不同時(shí)段的ALT和AST均低于手術(shù)組,差異具有顯著性(P<0.05);雷帕霉素組6 h和24 h的ALT和AST分別為(194.18±18.53)IU/L、(185.36±17.98)IU/L和(827.39±79.82)IU/L、(790.48±80.16)IU/L,均高于2 h(P<0.05)(表1)。
表1各組大鼠再灌注2、6、24h血清ALT和AST水平的比較
組 別ALT(IU/L)2h6h24hAST(IU/L)2h6h24h假手術(shù)組54.23±6.1951.68±6.2453.50±7.11132.83±14.52145.16±15.32 140.28± 13.96手術(shù)組215.16±22.46*258.47±25.61*▲377.48±35.65*▲★851.49±79.83*936.58±87.60*▲1106.74±102.57*▲★雷帕霉素組158.35±14.73*△194.18±18.53*△▲185.36±17.98*△▲716.35±70.06*△827.39±79.82*△▲790.48± 80.16*△▲
與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與手術(shù)組比較,△P<0.05;與2 h比較,▲P<0.05;與6 h比較,★P<0.05。
2.2各組血清MDA、SOD活性的變化手術(shù)組和雷帕霉素組的MDA均高于假手術(shù)組,雷帕霉素組的MDA均低于手術(shù)組;手術(shù)組和雷帕霉素組的SOD活性均低于假手術(shù)組,雷帕霉素組的SOD均高于手術(shù)組,差異具有顯著性(P<0.05);手術(shù)組24 h的MDA為(1.59±0.21)μmol/L,高于6 h(1.34±0.15)μmol/L和2 h(1.10±0.13)μmol/L,差異具有顯著性(P<0.05);6 h的MDA濃度高于2 h(P<0.05);手術(shù)組和雷帕霉素組的6 h和24 h的SOD為分別為(51.42±5.19)IU/L、(49.11±5.07)IU/L和(59.17±5.62)IU/L、(58.34±5.20)IU/L,均高于2 h(P<0.05);手術(shù)組和雷帕霉素組6 h和24 h的SOD比較差異無(wú)顯著性(表2)。
2.3各組血清TNF-α和IL-1活性的變化手術(shù)組和雷帕霉素組不同時(shí)段TNF-α和IL-1均高于假手術(shù)組,差異具有顯著性(P<0.05);雷帕霉素組不同時(shí)段的TNF-α和IL-1均低于手術(shù)組,差異具有顯著性(P<0.05);手術(shù)組24 h的TNF-α和IL-1分別為(70.47±6.92)pg/mL和(192.16±20.11)pg/mL,高于2 h和6 h(P<0.05);6 h的TNF-α和IL-1均高于2 h(P<0.05);雷帕霉素組6 h和24 h的TNF-α和IL-1分別為(39.38±4.19)pg/mL、(38.76±3.80)pg/mL和(123.61±13.08)pg/mL、(130.21±13.25)pg/mL,均高于2 h(P<0.05)(表3)。
表2各組大鼠再灌注2、6、24h血清MDA和SOD水平的比較
與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與手術(shù)組比較,△P<0.05;與2 h比較,▲P<0.05;與6 h比較,★P<0.05。
表3各組大鼠再灌注2、6、24h血清TNF-α和IL-1水平的比較
Tab.3 The serum TNF-α and IL-1 levels at 2, 6 and 24 h after reperfusion in different groups of rats
(pg/mL, n=6)
與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與手術(shù)組比較,△P<0.05;與2 h比較,▲P<0.05;與6 h比較,★P<0.05。
2.4病理組織學(xué)觀察結(jié)果光學(xué)顯微鏡下觀察,假手術(shù)組肝細(xì)胞形態(tài)正常,肝血竇無(wú)充血、腫脹,門管區(qū)未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);手術(shù)組隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)能見(jiàn)到肝竇充血、肝細(xì)胞腫脹、匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、還能見(jiàn)到灶狀壞死和點(diǎn)片狀壞死灶,以上改變?cè)谠俟嘧? h最為明顯。雷帕霉素組肝小葉結(jié)構(gòu)尚存,肝細(xì)胞輕度水腫,個(gè)別肝細(xì)胞胞核深染,部分肝血竇狹窄,門管區(qū)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。
圖1各組大鼠再灌注2、6、24h病理組織學(xué)觀察結(jié)果
Fig.1 The histopathologic results at 2, 6 and 24 h after reperfusion in different groups of rats (×200)
A:2 h手術(shù)組病理學(xué)改變;B:6 h手術(shù)組病理學(xué)改變;C:24 h手術(shù)組病理學(xué)改變;D:2 h雷帕霉素組病理學(xué)改變;E:6 h雷帕霉素組病理學(xué)改變;F:24 h雷帕霉素組病理學(xué)改變。
RAPA是放線菌培養(yǎng)液中分離的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,是一種強(qiáng)有力的免疫抑制劑[7],通過(guò)不同的細(xì)胞因子受體阻斷信號(hào)傳導(dǎo),阻斷T淋巴細(xì)胞及其他細(xì)胞由G1期至S期的進(jìn)程,從而發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)[8-9]。缺血再灌注損傷是缺血的組織器官重新獲得血液供應(yīng)后,并沒(méi)有使組織、器官功能得以恢復(fù),反而加重的現(xiàn)象,常出現(xiàn)在處理嚴(yán)重肝臟創(chuàng)傷、治療肝臟腫瘤及肝臟移植手術(shù)過(guò)程中。因此,肝臟缺血再灌注損傷的研究是肝臟外科的研究熱點(diǎn)之一[10]。
ALT和AST是人體內(nèi)糖和蛋白質(zhì)互相轉(zhuǎn)變所需的酶,ALT的分布以肝中最高,其次是腎、心、骨骼肌,血清ALT 、AST水平是反映肝損傷程度的靈敏指標(biāo), 檢測(cè)血清ALT、AST水平的變化可以反映肝損傷程度[11]。本次研究結(jié)果顯示,手術(shù)組和雷帕霉素組不同時(shí)段ALT和AST均高于假手術(shù)組(P<0.05),說(shuō)明肝臟缺血再灌注對(duì)肝臟造成損傷,雷帕霉素組不同時(shí)段的ALT和AST均低于手術(shù)組,差異具有顯著性(P<0.05);而隨著時(shí)間的延長(zhǎng),手術(shù)組逐漸加重,而雷帕霉素組6 h和24 h差異無(wú)顯著性(P>0.05),提示RAPA對(duì)肝臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用,本次研究與鄭傳東等研究結(jié)果相吻合[12]。
研究證實(shí),在血液供應(yīng)阻斷30 min以上就會(huì)引起各細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)的改變和功能障礙,及時(shí)恢復(fù)血液供應(yīng)可挽救這部分組織,然而大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察發(fā)現(xiàn),在成功恢復(fù)血流后,部分情況下反而使組織損傷加重,可能與氧自由基等相關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示,缺血再灌注組血清SOD 活性顯著減弱,同時(shí)伴隨MDA水平升高。雷帕霉素組6 h和24 h差異無(wú)顯著性,提示缺血再灌注時(shí)產(chǎn)生大量的因SOD活性降低導(dǎo)致氧自由基清除不足并引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),而RAPA可提高肝臟細(xì)胞SOD活性,減輕肝臟損傷。
RAPA抑制細(xì)胞周期G0期和G1期,阻斷G1進(jìn)入S期而發(fā)揮作用,其效應(yīng)之一為抑制IL-1、IL-2、IL-6和IFN-α誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖;研究表明,IL-1和TNF-α均是重要的促炎細(xì)胞因子,介導(dǎo)組織缺血再灌注損傷并發(fā)揮重要的作用[14]。TNF-α主要由單核巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生,參與肝病的免疫病理反應(yīng)及炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肝病發(fā)展。IL-1含量升高,表明機(jī)體內(nèi)有組織損傷或者感染產(chǎn)生。本次研究結(jié)果顯示,雷帕霉素組IL-1和TNF-A明顯減輕,與ALT和AST有相同的趨勢(shì),結(jié)合MDA和SOD 可以看出,RAPA可以清除肝臟缺血再灌注過(guò)程中生成的MDA,提高SOD活性,抑制IL-1 和TNF-α的釋放,從而減少對(duì)肝臟缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用。本次研究幾項(xiàng)指標(biāo)和病理切片結(jié)果相一致。
綜上所述,RAPA可以有效地改善肝缺血再灌注損傷,對(duì)缺血再灌注損傷肝臟具有明顯的保護(hù)作用,本次研究為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)RAPA控制肝臟損傷、增強(qiáng)肝臟缺血再灌注功能的作用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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