茆家定,陶 亮,吳 佩

(皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 胃腸二科，安徽 蕪湖 241001)

胃泌素是一種由胃竇和十二指腸黏膜G細(xì)胞分泌的一種肽類激素，對(duì)消化道黏膜有營(yíng)養(yǎng)作用。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)胃泌素可抑制細(xì)胞凋亡并且促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的增殖[1-2]，我們通過(guò)觀察胃泌素對(duì)體外培養(yǎng)的人大腸癌細(xì)胞株SW480增殖和凋亡的影響，以及P38蛋白表達(dá)情況及其磷酸化水平分析，初步探討P38-絲裂素活化蛋白激酶(motogen-actived protein kinase，MAPK)信號(hào)傳導(dǎo)通路在胃泌素促進(jìn)大腸癌細(xì)胞增殖中的作用及其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人大腸癌細(xì)胞株SW480購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胰蛋白酶購(gòu)自碧云天公司；5-肽胃泌素購(gòu)自Biosharp公司；丙谷胺購(gòu)自中國(guó)藥品生物檢定所；噻唑蘭(MTT)購(gòu)自Biosharp公司；細(xì)胞周期染色試劑盒購(gòu)自凱基公司；PVDF膜、牛血清蛋白、羊抗小鼠多克隆抗體、兔抗人多克隆抗體購(gòu)自Biosharp公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自Millipore公司；β-肌動(dòng)蛋白抗體購(gòu)自碧云天公司；P38及磷酸化P38兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling technology公司；Trizol 試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自加拿大Fermentas公司；螢光染料購(gòu)自Biosharp公司；胃泌素受體/膽囊收縮素-B受體(cholecystokinin-B receptor,CCK-BR)mRNA擴(kuò)增引物由上海生工生物公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 將SW480細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)，當(dāng)長(zhǎng)滿瓶壁的80%以上后進(jìn)行細(xì)胞傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化離心，去除消化液和培養(yǎng)液后加入凍存液，進(jìn)行細(xì)胞凍存，最終將其放入-70℃液氮箱中備用。本實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞分為胃泌素組(PG)、丙谷胺組(PGL)、胃泌素+丙谷胺組(PG+PGL)和對(duì)照組。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CCK-BR表達(dá) 按照Trizol試劑一步法提取細(xì)胞總RNA，之后再按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再以等量的cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95 ℃，30 s，之后每一步變性95 ℃，15 s，退火延伸53.9 ℃，30 s，共進(jìn)行39個(gè)循環(huán)；PCR結(jié)束后制作溶解曲線，95 ℃變性30 s，然后冷卻至65 ℃，從65 ℃開(kāi)始到95 ℃，每一步增加0.5 ℃，保持10 s。胃泌素/膽囊收縮素受體(CCK-2R)mRNA引物序列：上游5′-TCTCGCGAGCTCTACTTAGGG-3′,下游 5′-ACCGACGATGCACGTTGAAG-3′;β-肌動(dòng)蛋白 mRNA引物序列：上游 5′-TGACGTGGACATCGCAAG-3′,下游 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。其擴(kuò)增產(chǎn)物分別為185 bp、203 bp。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，以1 000 r/min離心5 min后棄去上清液，通過(guò)10%胎牛血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1.7×105個(gè)/ ml 的細(xì)胞懸液,接種于6孔培養(yǎng)板中(2 ml/孔),培養(yǎng)24 h后更換為無(wú)血清培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,吸去上清液,每孔加入含處理因素1%胎牛血清培養(yǎng)液2 ml。設(shè)胃泌素組(12.50 g/L)、丙谷胺組(16.00 mg/L)、胃泌素(12.50 mg/L)+ 丙谷胺(16.00 mg/L)組和對(duì)照組,每組各設(shè)5個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)48 h。結(jié)束培養(yǎng)時(shí),用不含EDTA的胰蛋白酶消化后,置離心機(jī)內(nèi)以15 000 r/min離心10 min，棄上清；加入1 ml冷的PBS輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，12 000 r/min離心10 min，棄上清。重復(fù)用冷的PBS洗兩次,棄去上清液后，緩慢滴入1 ml 70%冷乙醇固定，4 ℃保存過(guò)夜。第2日進(jìn)行DNA、蛋白質(zhì)染色,上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞儀測(cè)定,計(jì)算細(xì)胞周期中各期比例及增殖指數(shù)。

1.6 Western blot檢測(cè)P38蛋白及磷酸化P38表達(dá)水平 取定量的細(xì)胞總蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫下封閉2 h后，用TBST漂洗2次，加入一抗(P38和磷酸化P38用5%牛血清蛋白稀釋至1∶2 000)4 ℃搖床孵育過(guò)夜，用TBST洗3次后，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(用TBST稀釋至1∶5000)，溫室搖床孵育2 h，用TBST洗3次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒自顯影后，放入全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像系統(tǒng)內(nèi)成像。并用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行條帶平均光密度值分析，結(jié)果以目標(biāo)基因蛋白表達(dá)分別與β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)的比值表示。

2 結(jié)果

2.1 SW480細(xì)胞中CCK-BR mRNA表達(dá) CCK-BR mRNA熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為185 bp，qRT-PCR采用2-ΔCt的方法進(jìn)行分析。既往通過(guò)RT-PCR的方法已經(jīng)驗(yàn)證HT-29中有CCK-2R的表達(dá)將SW480細(xì)胞(1.58±0.17)與HT-29細(xì)胞(1.70±0.13)進(jìn)行比較,t=0.99,P>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SW480細(xì)胞存在著CCK-BR mRNA的表達(dá)。

2.2 各組SW480細(xì)胞增生活力檢測(cè)結(jié)果 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示:胃泌素濃度在6.25～200.00 mg/L范圍內(nèi)對(duì)SW480細(xì)胞有促生長(zhǎng)作用，當(dāng)胃泌素濃度增加到12.50 mg/L 時(shí)OD值最大，促增生能力最強(qiáng)(P<0.05)，繼續(xù)增加胃泌素濃度OD值并不隨其濃度增加而繼續(xù)升高；而胃泌素受體拮抗劑丙谷胺濃度為8.00～256.00 mg/L濃度時(shí)，對(duì)SW480細(xì)胞增生活力影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但胃泌素濃度為最佳濃度12.50 mg/L時(shí)，丙谷胺在一定范圍內(nèi)能明顯拮抗胃泌素促進(jìn)SW480細(xì)胞的增殖作用,其濃度在16.00 mg/L以上時(shí)，胃泌素+丙谷胺組活細(xì)胞數(shù)趨于一恒定值，丙谷胺最佳的拮抗?jié)舛葹?6.00 mg/L(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組SW480細(xì)胞增生活力檢測(cè)結(jié)果

注:a與對(duì)照組比較，P<0.05

2.3 各組細(xì)胞增殖指數(shù)檢測(cè)結(jié)果 胃泌素(12.50 mg/L)組細(xì)胞增殖指數(shù)為(34.56±1.41)%，顯著高于對(duì)照組的(28.74±1.61) %和胃泌素(12.50 mg/L)+丙谷胺(16.00 mg/L)組的(28.72±1.78)%(P<0.05)，而丙谷胺(16.00 mg/L)組細(xì)胞增殖指數(shù)為(27.75±2.29)%，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞增殖指數(shù)

注：a與其余三組比較，P<0.05

2.4 各組細(xì)胞中P38及其磷酸化水平 藥物作用SW480細(xì)胞48 h后，對(duì)照組、胃泌素(12.50 mg/L)組、丙谷胺(16.00 mg/L)組和胃泌素(12.50 mg/L)+丙谷胺(16.00 mg/L)組間P38的蛋白水平進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。胃泌素組(12.50 mg/L)低于對(duì)照組(P<0.01)，也低于胃泌素(12.50 mg/L)+丙谷胺(16.00 mg/L)組(P<0.05)。四組間磷酸化P38蛋白水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，差異顯著(P<0.01)。胃泌素組(12.50 mg/L)低于對(duì)照組(P<0.05)，也低于胃泌素(12.50 mg/L)+丙谷胺(16.00 mg/L)組(P<0.05)；丙谷胺(16 mg/L)磷酸化P38蛋白水平與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

3 討論

胃泌素的異常表達(dá)可導(dǎo)致大腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)失控形成腫瘤,其作用能夠被胃泌素受體拮抗劑丙谷胺抑制[3]。本研究結(jié)果顯示胃泌素在一定的濃度梯度范圍內(nèi)可促進(jìn)大腸癌SW480抑制凋亡、促進(jìn)增殖，當(dāng)濃度達(dá)到12.5 mg/L時(shí)繼續(xù)增加胃泌素濃度，抑制作用不再繼續(xù)增強(qiáng)，這一現(xiàn)象符合受體的飽和學(xué)說(shuō)。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，胃泌素能夠通過(guò)加速細(xì)胞周期S、G2期的進(jìn)程，促進(jìn)SW480細(xì)胞增殖,這種促增殖的作用能夠被其受體拮抗劑丙谷胺抑制。研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，丙谷胺單用對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響，當(dāng)胃泌素與丙谷胺聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，較單用胃泌素組細(xì)胞增殖指數(shù)明顯下降，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而且丙谷胺在一定濃度范圍內(nèi)可拮抗胃泌素的促增殖作用，其最佳濃度為16.00 mg/L，繼續(xù)增加濃度，拮抗作用不再增加，反而呈現(xiàn)減弱的現(xiàn)象。丙谷胺拮抗胃泌素的促增殖,從另一個(gè)角度證明了受體的飽和學(xué)說(shuō)。

表3 各組細(xì)胞中P38蛋白表達(dá)及磷酸化水平的比較

注：a與對(duì)照組比較,P<0.01；b與胃泌素組比較，P<0.01

胃泌素能夠與其受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，促進(jìn)大腸癌細(xì)胞增殖，但它是通過(guò)何種信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控仍不十分清楚。絲裂原活化蛋白激酶家族(MAPKs)參與細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，MAPKs包括ERK1/2、JNK、P38等主要組分，在多數(shù)細(xì)胞中，P38和JNK抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，ERK促進(jìn)細(xì)胞增殖，但在有些細(xì)胞中情況相反[4]。茆家定等人發(fā)現(xiàn)胃泌素可促進(jìn)HT-29增殖，同時(shí)胃泌素ERK1/2蛋白的磷酸化水平明顯高于對(duì)照組[5]。為了進(jìn)一步探討其具體分子機(jī)制,我們從P38信號(hào)傳導(dǎo)途徑著手了解胃泌素與此信號(hào)通路的關(guān)系。P38是真核細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)到細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的重要信號(hào)傳導(dǎo)蛋白激酶，是MAPK家族的一員，包括4種亞基，P38α、P38β、P38γ、P38δ。P38α是第一種被人類發(fā)現(xiàn)的P38 MAPK，其可被多種刺激因素激活，其中包括生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等。P38上游的MAPKK可通過(guò)磷酸化P38的Thr-Gly-Tyr位點(diǎn)中的酪氨酸使P38活化，再進(jìn)一步調(diào)控下游基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡[6]。所以，可以通過(guò)磷酸化來(lái)了解信號(hào)通路活化與否以及活化的強(qiáng)弱。下調(diào)P38使其發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，抑制Bcl-2的表達(dá)，啟動(dòng)Bax等P38下游基因的表達(dá)促進(jìn)凋亡[7]。本研究結(jié)果顯示胃泌素能顯著下調(diào)P38磷酸化水平，丙谷胺單獨(dú)作用對(duì)P38蛋白在SW480細(xì)胞中的磷酸化水平無(wú)明顯影響，但在丙谷胺與胃泌素聯(lián)合作用時(shí)，丙谷胺能顯著拮抗胃泌素使磷酸化-P38蛋白在SW480細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的作用，然而對(duì)各組間的P38蛋白表達(dá)水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢酝瞥鑫该谒貙?duì)于大腸癌細(xì)胞株SW480的促增殖、抑制凋亡作用，可能是通過(guò)下調(diào)磷酸化P38水平，降低P38的活化來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但此信號(hào)傳導(dǎo)通路能夠被胃泌素受體拮抗劑丙谷胺阻斷。

總之，胃泌素能夠促進(jìn)體外大腸癌SW480細(xì)胞增殖、抑制凋亡，并受胃泌素受體表達(dá)水平的限制，同時(shí)能夠被其受體拮抗劑丙谷胺抑制。P38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了胃泌素對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)控，其具體機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游哪種靶具體的基因來(lái)實(shí)現(xiàn)，仍需進(jìn)一步的研究。此外，如果我們能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制胃泌素受體或有效地干擾P38信號(hào)通路,促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，有望為胃泌素依賴型大腸癌綜合治療尋找到一條新的切入途徑。

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