封 艷， 牛巧麗， 尹宏斌， 鐘良軍， 趙 今

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1牙體牙髓科， 2頜面外科， 烏魯木齊 830054； 3杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科， 杭州 310015)

從體內(nèi)取得的培養(yǎng)組織在體外培養(yǎng)得到的大部分是各種混合細(xì)胞的生長，而在對體外培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究時都要求采用單一種類細(xì)胞進(jìn)行，以便能夠?qū)δ骋环N類細(xì)胞的功能、形態(tài)等的變化進(jìn)行研究。因此，培養(yǎng)細(xì)胞的純化就成為細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)研究的重要步驟。牙周膜組織中包含有成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞等具有異質(zhì)性的復(fù)雜的細(xì)胞群，而其中只有一小部分的細(xì)胞群具有牙周膜干細(xì)胞的自我更新能力。國內(nèi)外學(xué)者們一直致力于研究在牙周組織缺損處能大量出現(xiàn)牙周膜干細(xì)胞并促進(jìn)牙周再生[1]。所以，對牙周膜干細(xì)胞的培養(yǎng)、分離純化、鑒定等相關(guān)研究有著重要的理論價值和臨床意義。國內(nèi)外對牙周膜干細(xì)胞研究時多采用有限克隆稀釋法獲得牙周膜干細(xì)胞,但有關(guān)此方法具體操作的文獻(xiàn)不多。本研究對采用有限克隆稀釋法培養(yǎng)分離篩選人牙周膜干細(xì)胞的具體步驟、實(shí)驗(yàn)方法細(xì)節(jié)以及分離純化后人牙周膜干細(xì)胞的生物學(xué)活性的鑒定等方面進(jìn)行詳細(xì)的闡述，探討此方法的優(yōu)勢和特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑和儀器低糖DMEM培養(yǎng)基、美國胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶(Gibco公司，美國)，小鼠抗人STRO-1 單克隆抗體( R&D，美國),羊抗小鼠IgG-FITC 熒光二抗(eBioscience公司，美國)，DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國),PBS液、4%多聚甲醛(HyClone 公司，美國),雙抗、地塞米松、維生素C、β-磷酸甘油鈉、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobuty-1-methylxanthine，IBMX,上海索萊寶生物科技有限公司),小鼠抗人波形蛋白(Vimentin)、小鼠抗人角蛋白(PCK)、兔抗人骨鈣素、兔抗人骨橋蛋白、兔抗人Ⅰ型膠原、兔抗人Ⅲ型膠原、免疫組織化學(xué)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),各型號培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、凍存管、離心管(Corning Costar公司，美國)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純級。CO2清潔型培養(yǎng)箱(Heal Force，香港)，SW-CJ-2FD型高性能超凈工作臺(蘇州)，DMI400B型正置、倒置相差顯微鏡、Leica熒光顯微鏡和成像系統(tǒng)(Leica公司，德國)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原代培養(yǎng)人牙周膜干細(xì)胞(hPDLSCs) 在經(jīng)過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并獲取患者及監(jiān)護(hù)人的知情同意后，從正畸科臨床病人中取樣。標(biāo)本取自臨床上12～14歲因正畸治療需要拔除的牙周健康、無齲的新鮮前磨牙，移入離心管中，離心管中加有培養(yǎng)液(含100 mL /L 胎牛血清、200 mmoL /L谷胺酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基)并含高濃度雙抗(1 000 U/mL青霉素和1 000 μg/mL鏈霉素)。標(biāo)本需在含高濃度雙抗的培養(yǎng)基浸泡約30 min后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室超凈臺，用含高濃度雙抗的PBS(1 000 U/mL青霉素和1 000 μg/mL鏈霉素)反復(fù)沖洗，由冠向根單向刮取根中1/3的牙周膜組織，用新鮮培養(yǎng)液將刀片上的牙周膜組織沖至培養(yǎng)皿中，重復(fù)數(shù)次后，將含有牙周膜組織塊和低糖DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，前3 d組織塊未完全貼壁可不換液，第6、9天可以輕柔地半量換液，約12 d，組織塊周圍有細(xì)胞爬出時，可以全量換液，到組織塊周圍爬出的細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期時，含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 有限克隆稀釋法培養(yǎng)分離人牙周膜干細(xì)胞(hPDLSCs)

1.2.2.1 接種 首先在接種前先準(zhǔn)備適應(yīng)性培養(yǎng)基，收集的對數(shù)生長期牙周膜細(xì)胞的培養(yǎng)液按1 500 r/min離心10 min，經(jīng)0.22 μm直徑的小濾器過濾后,與新鮮配制的培養(yǎng)基以1∶1比例混合制成適應(yīng)性培養(yǎng)基[2-3]。原代培養(yǎng)的牙周膜細(xì)胞消化時盡量吹打成單個細(xì)胞，單個細(xì)胞至少占細(xì)胞懸液的90%以上，否則獲得單克隆的概率將減少。計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為10～15個/mL，種于96孔板，每孔加100 μL適應(yīng)性培養(yǎng)基，接種時不斷吹打混勻細(xì)胞懸液，避免細(xì)胞沉淀造成接種不勻。

1.2.2.2 標(biāo)記和換液 接種24 h后在帶有37℃恒溫板的倒置顯微鏡下開始觀察培養(yǎng)板中各孔細(xì)胞數(shù)，挑選只含1個細(xì)胞的孔做標(biāo)記，繼續(xù)培養(yǎng)。由于細(xì)胞貼壁時間長短不一，故同一塊96孔板還需在接種48～72 h再挑選1次單細(xì)胞孔。在確認(rèn)培養(yǎng)孔中的細(xì)胞數(shù)時，應(yīng)特別注意觀察培養(yǎng)孔的周邊，這些位置細(xì)胞折光弱不易看清，易漏記、錯記。最好由2個人合作，1個人看，1個人復(fù)查進(jìn)行確認(rèn)。每塊96孔板觀察時間盡量控制在2 h以內(nèi)，時間過長會影響單細(xì)胞貼壁和分裂，還可能造成96孔板邊緣的培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液蒸發(fā)或者污染。

接種5 d后不換液，也不做長時間觀察，只需在單細(xì)胞孔加20 μL新鮮培養(yǎng)液，每3天加1次。當(dāng)單個細(xì)胞形成50個細(xì)胞以上的細(xì)胞集落時(約在接種15 d)，對單細(xì)胞孔進(jìn)行每3天1次的半量換液，1 w后改為每3天1次的全量換液。

1.2.2.3 傳代轉(zhuǎn)種和擴(kuò)大培養(yǎng) 在接種96孔板6 w左右，孔中形成較大的克隆，待細(xì)胞克隆面積>96孔底面積的1/2，最好達(dá)到2/3時進(jìn)行轉(zhuǎn)種。消化時用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶，先將胰蛋白酶在37℃孵育箱預(yù)溫，96孔板每孔加胰蛋白酶30 μL，輕輕吹打孔底，尤其是孔底周邊，消化時間控制在1 min內(nèi)，用新鮮培養(yǎng)液200 μL終止消化。將細(xì)胞懸液移至48孔板的單孔內(nèi)，并加新鮮培養(yǎng)液至每孔600 μL體系。3 d后換液，待細(xì)胞匯合率達(dá)70%～80%時仍用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶每孔60 μL消化后，轉(zhuǎn)種到24孔板擴(kuò)大培養(yǎng)。同樣24孔板的細(xì)胞匯合率在達(dá)到70%～80%時轉(zhuǎn)種到12孔板，再轉(zhuǎn)種到6孔板及6 cm、10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)。此時從每個10 cm皿可以獲得1×106數(shù)量左右的純化人牙周膜干細(xì)胞單克隆細(xì)胞株。

1.2.3 人牙周膜干細(xì)胞的鑒定

1.2.3.1 流式細(xì)胞儀分析 將P7代牙周膜干細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)至約1×106/mL,0.25%含EDTA胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液, PBS洗2遍后轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管,加預(yù)冷的PBS132 μL重懸細(xì)胞,吹勻后加入預(yù)冷的95%乙醇368 μL吹打混勻, 4 ℃過夜后，每只EP管中加4 μL RNA酶，37℃孵育30 min，每管避光加入5 mL/L的碘化丙錠(PI)0.4 mL, 4 ℃染色30 min, 300目的尼龍篩網(wǎng)過濾樣品后,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.3.2 免疫熒光人牙周膜干細(xì)胞特異性抗原表達(dá) 取生長良好P7代的克隆化培養(yǎng)的純化的人牙周膜干細(xì)胞，按2×104/mL接種于3.5 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)5 d細(xì)胞匯合率達(dá)70%時固定進(jìn)行熒光染色。4%的多聚甲醛2 mL固定過夜。為去除內(nèi)源性過氧化物酶，加3%過氧化氫溶液2 mL室溫作用30 min，再加1%Triton 2 mL室溫作用30 min，以上每一步都用PBS洗3遍，加入1 mL 5%山羊血清37℃封閉30 min。直接甩去山羊血清，然后滴加適量稀釋后的鼠抗人STRO-1單克隆抗體(1∶500)以及鼠抗人CD146單克隆抗體(1∶500)，陰性對照組以PBS作為一抗滴加，置于濕盒中4 ℃過夜。次日PBS洗3遍洗去一抗，避光加入1∶1 000稀釋的FITC熒光標(biāo)記二抗1 mL，37 ℃避光孵育1 h，吸取二抗棄之，避光加Hoechest33342復(fù)染核15 min。激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.4 PDLSCs骨向分化能力的檢測

1.2.4.1 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 將P7代牙周膜干細(xì)胞以密度為1×104/mL接種于3.5 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，加入成骨誘導(dǎo)劑(0.1 μmol/L地塞米松、50 mg/L維生素C、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉)培養(yǎng)7 d進(jìn)行染色。細(xì)胞處理步驟同免疫熒光的細(xì)胞處理，在滴加一抗時有小鼠抗人波形蛋白(Vimentin)、兔抗人骨鈣素(OC)、兔抗人骨橋蛋白(OPN)、兔抗人Ⅰ型膠原(COL-Ⅰ)、兔抗人Ⅲ型膠原(COL-Ⅲ) 、小鼠抗人角蛋白(PCK)，抗體稀釋按照1∶50比例，置于濕盒中4℃過夜。次日PBS洗3遍洗去一抗，加入通用型二抗，非避光孵育1 h，PBS洗去二抗，加DAB染色液(DAB緩沖液取1 mL加DAB濃縮液1滴混勻),立即在顯微鏡下觀察染色程度，適中時用蒸餾水沖洗終止染色，反復(fù)沖洗幾遍后，加入蘇木素染液復(fù)染細(xì)胞核，室溫作用5 min后蒸餾水沖洗，即可在倒置相差顯微鏡下觀察。

1.2.4.2 茜素紅鈣鹽染色 將P7代牙周膜干細(xì)胞以密度為2×104/mL接種于3.5 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，加入成骨誘導(dǎo)劑進(jìn)行骨誘導(dǎo)，對照組為不含誘導(dǎo)劑的常規(guī)培養(yǎng)基。每3天換液1次，4 w后觀察并用茜素紅鈣鹽染色法測定PDLSCs的骨向分化能力。

2 結(jié)果

2.1PDLSCs的分離和純化手術(shù)刀尖上為從離體牙牙根2/3處刮下的牙周膜組織塊，3.5 cm培養(yǎng)皿里有牙周膜組織塊和培養(yǎng)液(圖1)。組織塊法培養(yǎng)約10 d可見細(xì)胞從組織塊中爬出，右上角黑褐色膜塊狀物為牙周膜組織塊。原代培養(yǎng)的牙周膜細(xì)胞主要為短梭形, 1～2 個突起,少數(shù)為多邊形、紡錘狀或橢圓形, 細(xì)胞體積較小，核居中，胞核和胞漿都較飽滿(圖2)。

2.2克隆形成情況在含有適應(yīng)性培養(yǎng)基的96 孔板接種細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后單個細(xì)胞貼壁，可見細(xì)胞伸長并伸出較長的突起，并開始產(chǎn)生新的分裂(圖3a)。細(xì)胞接種10～15 d后有30個左右細(xì)胞形成較小的克隆(圖3b)，計(jì)算細(xì)胞克隆形成率為6.13%。細(xì)胞接種35～45 d時鏡下可以觀察到較大克隆狀生長的細(xì)胞集落，中心密集的細(xì)胞邊界不清，呈圓形或不規(guī)則形，排列呈旋渦。周邊的細(xì)胞呈梭形或多角形,部分細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞狀，細(xì)胞之間排列緊密(圖3c)。

a: 接種24 h 96孔板單個細(xì)胞狀態(tài)(100×，DIC)b: 接種約15 d 96孔板中約30個細(xì)胞的集落(50×，BF)c: 接種40 d 96 孔板中較大細(xì)胞集落(50×，PH)

2.3分離純化人牙周膜干細(xì)胞株牙周膜干細(xì)胞在純化培養(yǎng)時會出現(xiàn)數(shù)量較多的圓形、卵圓形的純化的牙周膜干細(xì)胞，細(xì)胞核非常豐富和飽滿，胞漿少，核漿比例高，呈幼稚生長狀態(tài)，與其周圍的長梭形牙周膜細(xì)胞有明顯的區(qū)別。P7代純化的牙周膜干細(xì)胞呈非對稱分裂，既可以對稱性性分裂成2個圓形牙周膜干細(xì)胞，也可以非對稱分裂成長梭形的成體牙周膜細(xì)胞(圖4)。

2.4流式細(xì)胞分析牙周膜干細(xì)胞的細(xì)胞周期牙周膜干細(xì)胞細(xì)胞周期絕大多數(shù)處于G0/G1期(75.9%),即靜止期及DNA合成前期。G2期細(xì)胞為24.1%,S期細(xì)胞為0,大部分處于靜止期或緩慢增殖期(圖5)。

2.5免疫熒光檢測牙周膜干細(xì)胞特異性蛋白表達(dá)牙周膜干細(xì)胞純化后STRO-1、CD146免疫熒光染色均為陽性表達(dá)，激光共聚焦顯微鏡下顯示STRO-1不僅在干細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)，胞漿呈現(xiàn)綠色熒光，隨著染色時間的延長，在干細(xì)胞胞核內(nèi)也出現(xiàn)STRO-1的陽性表達(dá)，本是藍(lán)染的胞核與胞核內(nèi)STRO-1綠色表達(dá)重疊后呈現(xiàn)藍(lán)綠色(圖6)。而CD146只在胞漿中表達(dá)，胞漿呈現(xiàn)綠色，胞核呈Hoechest33342復(fù)染后的藍(lán)色(圖7)。

2.6牙周膜干細(xì)胞骨向誘導(dǎo)分化后免疫細(xì)胞化學(xué)染色牙周膜干細(xì)胞經(jīng)骨誘導(dǎo)后，胞漿中COL-Ⅰ、OPN、COL-Ⅲ、Vimentin、BGP陽性表達(dá)，表現(xiàn)為胞漿呈棕黃色，胞核經(jīng)蘇木素復(fù)染呈藍(lán)色(圖8a～e)。PCK為陰性表達(dá)，表現(xiàn)為藍(lán)色胞漿，藍(lán)紫色胞核(圖8f)。而未誘導(dǎo)的人牙周膜干細(xì)胞胞漿中除Vimentin為陽性表達(dá)及PCK為陰性表達(dá)外, COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、BGP、OPN均為弱陽性表達(dá)。

a: 兔抗人Ⅰ型膠原(COL-Ⅰ)陽性表達(dá)，胞漿呈棕黃色b: 兔抗人骨橋蛋白(OPN)陽性表達(dá)，胞漿呈棕黃色c: 兔抗人Ⅲ型膠原(COL-Ⅲ)陽性表達(dá)，胞漿呈棕黃色

圖8 骨誘導(dǎo)后牙周膜干細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色特異性蛋白的表達(dá)(200×，BF)

d: 小鼠抗人波形蛋白(Vimentin)陽性表達(dá)，胞漿呈棕黃色e: 兔抗人骨鈣素(BGP)陽性表達(dá)，胞漿呈棕黃色f: 小鼠抗人角蛋白(PCK)陰性表達(dá)，呈藍(lán)色胞漿

2.7茜素紅鈣鹽染色牙周膜干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞數(shù)量增多，形態(tài)變小，排列緊密，細(xì)胞的長梭形突起短縮，局部呈復(fù)層生長。12 d左右細(xì)胞密集區(qū)出現(xiàn)許多小的細(xì)胞堆積物，并逐漸增大。14 d茜素紅染色，可見紅色礦化結(jié)節(jié)(圖9)。

3 討論

通常細(xì)胞分離純化方法分為自然純化和人工分離純化2種。由于無法人為地選擇細(xì)胞，自然純化的方法逐漸被淘汰。人工分離純化細(xì)胞的方法比較多，除密度梯度離心、反復(fù)貼壁法、機(jī)械刮除法、培養(yǎng)基限定法以外，目前比較常用的是有限克隆稀釋法、流式細(xì)胞分選方法、免疫磁珠分選法。

免疫磁珠分選法是一種十分簡捷高效的細(xì)胞分離純化的方法，具有分離純度高、細(xì)胞處理量大、分選方式靈活及細(xì)胞分離后仍保持很好活力等優(yōu)勢。研究表明，免疫磁珠運(yùn)用于分離牙周膜干細(xì)胞的獲得率<1%[4]；免疫磁珠分選法也有其弱點(diǎn)，價格昂貴是制約其廣泛應(yīng)用的主要因素，還有其他一些因素，如：標(biāo)記的抗體的磁珠若選擇過大，則分選細(xì)胞可能會導(dǎo)致細(xì)胞激活或影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)；孵育時間過長會引起非特異性結(jié)合。免疫磁珠還有可能和死亡細(xì)胞非特異性結(jié)合，降低了分選效率等[5]。利用流式細(xì)胞儀分離牙周膜干細(xì)胞，方法簡單易行，獲得牙周膜干細(xì)胞的速度較快[6-7]。但其需特殊的器械，對細(xì)胞數(shù)量的要求也比較多，費(fèi)用較高。另外由于流式細(xì)胞儀自身作用機(jī)理，分選后的細(xì)胞部分受損而死亡。

有限稀釋克隆法不需要特殊設(shè)備，操作簡單，實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)小，適合大批量的克隆純化培養(yǎng)，已廣泛用于異質(zhì)性細(xì)胞系的克隆和培養(yǎng)，是目前最常用的方法。但是利用有限稀釋克隆法分離的牙周膜干細(xì)胞速度慢。本研究顯示，從1個單細(xì)胞擴(kuò)增到1×106數(shù)量級需要80～90 d。另外在本實(shí)驗(yàn)過程中，接種于96孔板單細(xì)胞孔的檢出率為18%～25%，平均為21%，但是能在96孔板中形成克隆并達(dá)到傳代的集落只占到6.1%，其余單細(xì)胞孔的細(xì)胞不增殖或增殖緩慢，最終老化死亡。而在細(xì)胞克隆傳代過程中，胰酶作用過長，細(xì)胞會死亡；胰酶作用過短，細(xì)胞未完全脫離貼壁，兩者均造成消化后細(xì)胞數(shù)量過少，從而使得傳代后細(xì)胞增殖緩慢，出現(xiàn)分化或污染。另外有限稀釋克隆法步驟較為煩瑣，耗時長，在此過程中容易出現(xiàn)細(xì)胞污染，以上因素使得最終細(xì)胞克隆率為1.2%，比張玉峰等[8]的研究結(jié)果細(xì)胞克隆率為2.3%要低。但有限稀釋克隆法在實(shí)驗(yàn)條件簡單、經(jīng)費(fèi)少、時間充裕的情況下不失為獲得牙周膜干細(xì)胞較有效的方法，故在牙周膜干細(xì)胞分離純化時需根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件、經(jīng)費(fèi)、時間等因素進(jìn)行選擇。對于免疫磁珠分選法、流式細(xì)胞儀分選法、有限稀釋克隆法對牙周膜干細(xì)胞分離純化的純度、回收率以及分離后細(xì)胞活性的比較將是進(jìn)一步的研究內(nèi)容。

成體干細(xì)胞主要以對稱性分裂和非對稱性分裂2種方式生長，對稱性分裂形成2個相同的干細(xì)胞，非對稱性分裂生成1個分化細(xì)胞，而另1個仍作為干細(xì)胞保留下來[9-10]。各種成體干細(xì)胞的體內(nèi)外生長特性和表型可能不盡一致，但成體干細(xì)胞通常處于靜息狀態(tài)，分裂緩慢，在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為細(xì)胞體積小，胞內(nèi)細(xì)胞器稀少，細(xì)胞內(nèi)RNA含量低，在組織結(jié)構(gòu)中位置相對固定[11]。本研究顯示，經(jīng)過有限稀釋克隆法富集和純化的牙周膜干細(xì)胞，在倒置顯微鏡下可以觀察到其作為成體干細(xì)胞這種對稱分裂和非對稱分裂2種生長方式；從形態(tài)學(xué)同樣觀察到牙周膜干細(xì)胞胞核非常豐富和飽滿，而胞漿較少，整體細(xì)胞體積較牙周膜細(xì)胞小，與Vander-Kooy等[9]與Vogel[11]等的研究結(jié)論一致。

本研究認(rèn)為在有限稀釋克隆法分離牙周膜干細(xì)胞中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：(1)盡量選用原代培養(yǎng)的細(xì)胞，在原代培養(yǎng)的細(xì)胞中牙周膜干細(xì)胞比例較高，相應(yīng)在稀釋后得到單個牙周膜干細(xì)胞的概率也就較高。(2)在稀釋后做單細(xì)胞接種時，需多接種幾塊96孔板。(3)在單細(xì)胞培養(yǎng)和形成集落的過程，以及維持干細(xì)胞狀態(tài)作用中，都需要提高培養(yǎng)液中胎牛血清的濃度，一般提高到15%～20%的血清濃度。(4)為避免干細(xì)胞出現(xiàn)分化，除需提高血清濃度以及及時換液外，細(xì)胞匯合率達(dá)到70%～80%就需進(jìn)行牙周膜干細(xì)胞傳代，細(xì)胞匯合率80%干細(xì)胞易發(fā)生分化。

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