袁可 陳玉鳳 張立生

·實驗研究·

營養(yǎng)不良對仔鼠胰島素和nestin蛋白水平的影響

袁可 陳玉鳳 張立生

目的連續(xù)觀察營養(yǎng)不良仔鼠生后血糖、血清胰島素的水平, 并檢測其胰腺組織中insulin(胰島素)和nestin(巢蛋白)mRNA表達(dá)水平, 探討營養(yǎng)不良在仔鼠胰腺發(fā)育過程中的影響。方法用低蛋白飲食法低出生體重仔鼠的模型, 實驗組(R組)母鼠在21 d哺乳期繼續(xù)低蛋白飲食喂養(yǎng)；對照組(C組)母鼠給予正常蛋白飲食喂養(yǎng)。仔鼠出生1、7、14、21 d采血監(jiān)測血糖和血清胰島素值；RTPCR檢測胰島素和nestin mRNA水平的表達(dá)。結(jié)果各時間點(diǎn)：①R組仔鼠體重均低于C組；②血糖和血清胰島素水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；③R組胰腺中胰島素和nestin mRNA水平均低于C組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論宮內(nèi)營養(yǎng)不良可導(dǎo)致仔鼠低體重, 生后早期其血糖和血清胰島素水平雖然較對照組相比尚無改變, 但胰腺中胰島素含量已發(fā)生明顯的改變, β細(xì)胞的再生減少可能是其機(jī)制。

營養(yǎng)不良；胰島素；nestin蛋白

近些年來不斷有流行病學(xué)資料和動物實驗研究表明：出生時體重偏低者在成年后發(fā)生糖耐量減低和II型糖尿病的風(fēng)險顯著增加。因此研究胎兒生長與成年期疾病的潛在機(jī)制成為圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)和新生兒學(xué)的研究熱點(diǎn)。作者連續(xù)觀察營養(yǎng)不良仔鼠生后血糖、血清胰島素的水平, 并檢測其胰腺組織中insulin和nestin mRNA表達(dá)水平, 探討營養(yǎng)不良在仔鼠胰腺發(fā)育過程中的影響。

1 材料與方法

1.1動物模型 使10只健康的三月齡SD雌鼠受孕成功,之后隨機(jī)分為兩組：實驗組(R組)自受孕成功后開始10%低蛋白飼料喂養(yǎng), 并持續(xù)喂養(yǎng)至在仔鼠出生后21 d；對照組(C組)自受孕成功后給予正常蛋白飼料喂養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1體重、血糖和血清胰島素測定 各組仔鼠于生后1、7、14、21 d稱重后斷頭取血, 測定血糖, 余血樣放射免疫法測血清胰島素水平。

1.2.2mRNA定量分析 完整分離生后第1、7、14、21天的兩組仔鼠的胰腺組織, 提取總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在同一反應(yīng)體系內(nèi)PCR擴(kuò)增cDNA, insulin產(chǎn)物為236 bp；nestin產(chǎn)物為283 bp。內(nèi)對照GAPDH產(chǎn)物451 bp。將擴(kuò)增成功的cDNA產(chǎn)物加入瓊脂糖凝膠后進(jìn)行電泳, 再利用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描, 獲得的不同的OD值, 最后用insulin和nestin與GAPDH 的OD比值, 將insulin和nestin mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行半定量分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用t檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

隨出生日齡的增加：①R組仔鼠的體重和C組仔鼠一樣在不斷增加, 但在各個時間點(diǎn)均顯著低于C組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；②R組仔鼠的空腹血糖和血清胰島素水平無顯著變化, 且與C組比較差異無統(tǒng)計意義(P＞0.05)；③兩組仔鼠的胰腺組織中胰島素和nestin mRNA表達(dá)均逐步增加,在每個時間點(diǎn), R組的表達(dá)量均顯著低于C組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 Insulin mRNA和nestin mRNA含量呈正相關(guān),在R組兩者相關(guān)系數(shù)r為0.674(P=0.013), C組兩者的相關(guān)系數(shù)r為0.775(P=0.002)。見表1。兩組仔鼠第21天時insulin和nestin mRNA電泳結(jié)果, 見圖1。

圖1 兩組仔鼠第21天時胰腺insulin 和nestin mRNA

表1兩組仔鼠不同時間點(diǎn)體重、insulin 和nestin mRNA的比較n=6)

表1兩組仔鼠不同時間點(diǎn)體重、insulin 和nestin mRNA的比較n=6)

注：與對照組(C組)比較,aP＜0.05

指標(biāo)第1天 postnatal day 1第7天 postnatal day 7第14天 postnatal day 14第21天 postnatal day 21 R組C組R組C組R組C組R組C組Body weighy (g) 6.44±0.22a7.08±0.4110.48±0.82a14.33±0.6616.86±2.39a27.01±2.1323.01±3.14a45.32±7.59 insulin mRNA0.532±0.047a0.723±0.0390.607±0.094a0.797±0.0750.675±0.048a0.854±0.1020.734±0.110a0.918±0.057 nestin mRNA0.204±0.007a0.263±0.0140.243±0.013a0.357±0.0280.267±0.025a0.414±0.0110.298±0.014a0.475±0.046

3 討論

針對Pima印地安人的一項流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：出生體重與成年后糖尿病發(fā)生率存在U形關(guān)系, 即低出生體重者較高出生體重者具有更高的糖尿病發(fā)生率(25.0% VS 18.2%)。米杰等［1］的一項針對中國人的流行病學(xué)研究也顯示出生時的營養(yǎng)不良是其成年期發(fā)生II型糖尿病的獨(dú)立危險因素。關(guān)于營養(yǎng)不良與發(fā)生成年期疾病的潛在機(jī)制, Lucas首先在1998年提出“營養(yǎng)程序化［2］”概念, Wzanne在2001年進(jìn)一步提出“代謝程序化［3］”概念。他們認(rèn)為：在出生早期機(jī)體會對營養(yǎng)不良產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng), 導(dǎo)致胰島的內(nèi)分泌功能和結(jié)構(gòu)在生命早期即發(fā)生潛在的改變, 這種不易覺察的改變將持續(xù)至成年期, 最終導(dǎo)致2型糖尿病易患性增加。1999年的一項研究發(fā)現(xiàn)低出生體重兒可最早在7歲時檢測到糖耐量異常［4］。

圍產(chǎn)期發(fā)育中的許多器官存在重構(gòu)(remodeling), 即圍生期組織細(xì)胞的凋亡、增殖和再生均處于較成年期的高水平,此后至成年期該組織細(xì)胞的凋亡、增殖和再生水平顯著下降, 其總數(shù)量或比例基本確定。Scaglia等［5］實驗發(fā)現(xiàn)大鼠的胎兒期至生后21 d(相當(dāng)于人類胎兒至哺乳期)是大鼠胰島重構(gòu)的關(guān)鍵時期, 此后胰島的結(jié)構(gòu)和功能將被“程序化”,將對血糖的自穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生終生的影響。本實驗動態(tài)觀察了生后21 d內(nèi)營養(yǎng)不良組仔鼠血糖和血清胰島素水平, 顯示其尚能保持正常水平, 未出現(xiàn)胰島素抵抗, 但是胰腺中的胰島素含量已經(jīng)出現(xiàn)減少。Nestin是一種在胚胎時期高度表達(dá)的中間絲蛋白, 現(xiàn)被公認(rèn)為是神經(jīng)干細(xì)胞或前體細(xì)胞的標(biāo)志物之一。2000年, Hunziker等［6］首先報道在胰島中也存在nestin 陽性細(xì)胞, 體外實驗則發(fā)現(xiàn), nestin陽性的胰腺導(dǎo)管細(xì)胞可在體外誘導(dǎo)分化為具有分泌胰島素功能的β細(xì)胞［7］。因此從nestin陽性的內(nèi)分泌前體細(xì)胞到新生β細(xì)胞的分化過程是胰島重構(gòu)的重要環(huán)節(jié)。本研究結(jié)果顯示營養(yǎng)不良組仔鼠的胰腺組織中nestin mRNA含量雖隨日齡緩慢上升, 但均顯著低于同日齡的對照組, 且與insulin mRNA水平呈正相關(guān)。故推測營養(yǎng)不良可能使仔鼠胰腺中內(nèi)分泌前體細(xì)胞數(shù)量下降, 從而損害了β細(xì)胞的分化, 改變了仔鼠胰島重構(gòu)、最終使胰腺中胰島素含量下降。

新生兒期營養(yǎng)狀況對胰腺β細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)不良的仔鼠在生后21 d內(nèi), 血糖和血胰島素水平尚未出現(xiàn)異常, 但其胰腺組織中insulin和nestin mRNA表達(dá)量已下降。因此在臨床工作中遇到低出生體重新生兒時, 不僅要關(guān)注血糖、血清胰島素水平等血液指標(biāo)有無異常的表面現(xiàn)象, 更要預(yù)見到低出生體重新生兒的胰島β細(xì)胞發(fā)育可能已經(jīng)受損。如果不能及時有效的改善其營養(yǎng)狀況, 將可能使得β細(xì)胞再生減少, 影響胰島正常發(fā)育, 進(jìn)而導(dǎo)致其成年期II型糖尿病的發(fā)生。因此, 在胎兒、特別是生后早期這個胰島重構(gòu)的敏感時期尋求一種有效的方法, 對低出生體重新生兒進(jìn)行積極有效的早期干預(yù), 將有望改善胰島重構(gòu), 最終達(dá)到成年期疾病生后早期防治的目的。

［1］ 米杰, 程紅, 趙小元, 等.出生重量指數(shù)對中年罹患代謝綜合征的預(yù)測作用.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2004, 38(4):221-225.

［2］ McMillen IC, Edwards LJ, Duffield J, et al.Regulation of leptin synthesis and secretion before birth: implications for the early programming of adult obesity.Reproduction, 2006, 131(3):415-427.

［3］ Reusens B, Remacle C.Programming of the endocrine pancreas by the early nutritional environment.Int J Biochem Cell Biol, 2006, 38(5-6): 913-922.

［4］ Hoet JJ, Hanson MA.Intrauterine nutrition: Its importance during critical periods for for cardiovascular and endocrine development.J Physiol, 1999, 514(Pt3):617-627.

［5］ Scaglia L, Cahill CJ, Findgood DT, et al.Apoptosis participates in the remodeling of the endocring pancreas in the neonatal rat.Endocrinology, 1997, 138(4):1736-1741.

［6］ Hunziker E, Stein M.Nestin-expressing cells in the pancreatic islets of langerhans.Biochem Biophys Res Commun, 2000(271):116.

［7］ Kim SY, Lee SH, Kim BM, et al.Activation of nestin-positive duct stem (NPDS) cells in pancreas upon neogenic motivation and possible cytodifferentiation into insulin-secreting cells from NPDS cells.Dev Dyn, 2004, 230(1):1-11.

2014-07-24］

266000 青島市婦女兒童醫(yī)院新生兒重癥監(jiān)護(hù)室(袁可 張立生)；新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科(陳玉鳳)