徐妍 張慧 劉江峰 朱玉婷 田愛峰 范長斌 黃江勇 吳瑛 于淼 林鳳燕 趙爽 陳晶礪 畢曉云

雙磷酸鹽是一種人工合成藥物，廣泛用于骨吸收性疾病，尤其適用于60歲以上老年患者[1]。這類藥物也用于骨腫瘤及腫瘤骨轉(zhuǎn)移的輔助治療。雙磷酸鹽可調(diào)節(jié)骨代謝，主要作用在于吸附于破骨細(xì)胞表面，抑制破骨細(xì)胞活性，引起破骨細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致骨吸收減少[2]。近年來的研究表明，雙磷酸鹽也可作用于其他類型細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，抑制細(xì)胞增殖，減低細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞分泌生長因子和Ⅰ型膠原[3-6]。在吸附雙磷酸鹽的骨組織表面可以形成新骨，但藥物與新生骨中的基質(zhì)結(jié)合后不再具有藥理活性，必須持續(xù)服用這類藥物，以抑制新形成骨表面的破骨細(xì)胞。然而，骨壞死是長期服用雙磷酸鹽嚴(yán)重的副作用，發(fā)生機(jī)制尚不清楚，但推測可能與其對成骨細(xì)胞的毒性有關(guān)。

間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是一種成體干細(xì)胞，具有分化為成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞等的能力。MSC廣泛存在于骨髓及骨實(shí)質(zhì)組織中。雙磷酸鹽的毒性反應(yīng)是否與MSC有關(guān)，至今尚未見報(bào)道。我們以帕米膦酸二鈉為研究對象，觀察藥物處理后的人骨髓MSC在表面分子表達(dá)、增殖狀態(tài)及成骨分化能力等的變化，以探索雙磷酸鹽導(dǎo)致骨組織損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨髓MSC為本研究室保存，取第1～3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。帕米膦酸二鈉注射液(2 mg/mL)為國內(nèi)藥物制劑。胎牛血清(Stem Cell公司，加拿大)。MTT、地塞米松、維生素C磷酸鹽、β磷酸甘油、人胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉和磷酸對硝基苯酚(Sigma公司，美國)。小鼠抗人CD31、CD44、CD45、CD73抗體(BD公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 人骨髓MSC的復(fù)蘇與培養(yǎng)

[7]的方法。取液氮凍存的人骨髓MSC 3份，37℃快速復(fù)蘇，滴加于含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中，離心洗滌后按10 000 cells/cm2底面積接種于100 mm培養(yǎng)皿中。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h，胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次，將細(xì)胞懸浮于α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106cells/mL，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)

收取人骨髓MSC，懸浮于含1%FCS的α-MEM中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106cells/mL。體系中分別加入終濃度為0 μg/mL、0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL的帕米膦酸二鈉，以終濃度為10%的FCS為陽性對照。在上述體系中加入MSC懸液30 μL/mL。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至96孔板，每孔100 μL。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h，加入MTT溶液。酶聯(lián)免疫儀上測定每孔光密度值，測定波長為490 nm。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，分別采用3個骨髓標(biāo)本來源細(xì)胞。

1.2.3 流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)

MSC培養(yǎng)體系中加入1.0 μg/mL的帕米膦酸二鈉，培養(yǎng)1周后收集細(xì)胞，PBS洗滌2次。加入小鼠抗人CD31、CD44、CD73、CD45單克隆抗體。室溫避光反應(yīng)30 min后，PBS洗滌2次。FACSCalibur(美國BD公司)收集至少10 000個數(shù)據(jù)點(diǎn)，WINMDI2.9軟件分析結(jié)果。

1.2.4 成骨誘導(dǎo)分化

將培養(yǎng)的人骨髓MSC，懸浮于含5%FCS的DMEM中，按3.0×103個/孔的密度，接種到24孔板中。分為4組，分別加入含5%FCS的DMEM(陰性對照組)、0.5 μg/mL帕米膦酸二鈉、標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)劑組合及誘導(dǎo)劑組合+0.5 μg/mL帕米膦酸二鈉。誘導(dǎo)劑組合由地塞米松(100 nM)、β-磷酸甘油(10 mM)和維生素C磷酸鹽(50 μM)組成。每隔3～4天換液1次。第14天時收集細(xì)胞，裂解后分別進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度及堿性磷酸酶(ALP)活性測定。使用3個不同供者來源的MSC重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 堿性磷酸酶活性檢測

取第14天細(xì)胞，PBS洗滌后凍融裂解。1 500 r/min離心10 min，取上清，Bradford法測定蛋白濃度，結(jié)果以O(shè)D600表示。配制堿性磷酸酶工作液，包括5 mM磷酸對硝基苯酚水溶液、50 mM甘氨酸水溶液(pH 10.5)、1.0 mM氯化鎂水溶液，按1∶1與細(xì)胞裂解液混合，37℃反應(yīng)15 min。加入NaOH終止液后，酶聯(lián)儀測定405 nm光密度值。將堿性磷酸酶測定的OD405值與各組對應(yīng)蛋白含量的OD600比值，作為各組單位蛋白重量堿性磷酸酶活性進(jìn)行比較。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

MTT實(shí)驗(yàn)所得光密度值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用t檢驗(yàn)分析，P0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度帕米膦酸二鈉對人MSC增殖的影響

在MSC培養(yǎng)體系中加入0.1～10 μg/mL的帕米膦酸二鈉，培養(yǎng)72 h，MTT法測定細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，當(dāng)藥物濃度為0.1 μg/mL和0.5 μg/mL時，OD490與對照組無顯著差別(P0.05)；當(dāng)藥物濃度達(dá)到1 μg/mL時，OD490顯著低于對照組(P0.05)；之后OD值逐漸減低，以10 μg/mL組最為明顯，顯著低于對照組(P0.05)(圖1)。

圖1 不同濃度帕米膦酸二鈉對MSC增殖的影響Fig.1The inhibitory effect of different concentrations of pamidronate disodium on the growth of human bone marrow MSCs

圖2 帕米膦酸二鈉處理的MSC表型分析Fig.2Phenotypic profile of human MSCs treated by parmidronate

2.2 帕米膦酸二鈉對MSC表面分子特征的影響

由于1 μg/mL帕米膦酸二鈉明顯抑制MSC增殖，我們選擇0.5 μg/mL作為長期培養(yǎng)時的藥物濃度。將細(xì)胞培養(yǎng)1周后，流式細(xì)胞觀察細(xì)胞表面分子表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，MSC仍高表達(dá)CD44和CD73，不表達(dá)CD31和CD45，提示藥物作用后，細(xì)胞仍具有MSC表面分子特征(圖2)。

2.3 帕米膦酸二鈉對MSC體外成骨分化的影響

為觀察帕米膦酸二鈉是否影響MSC成骨能力，MSC體系中加入0.5 μg/mL帕米磷酸鈉，培養(yǎng)2周后裂解細(xì)胞，磷酸對硝基苯酚顯色，測定OD405以顯示細(xì)胞堿性磷酸酶活性。結(jié)果顯示，帕米膦酸二鈉組OD405與陰性對照組相當(dāng)(P0.05)，顯著低于標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)組(P0.01)，而誘導(dǎo)劑加帕米膦酸二鈉組OD值與標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)組無差異。鑒于帕米膦酸二鈉可抑制MSC增殖，以細(xì)胞蛋白總量為指標(biāo)(OD600)，顯示細(xì)胞總數(shù)，將OD405/OD600作為單位細(xì)胞所含ALP活性，獲得了近似的結(jié)果。以上結(jié)果表明，帕米膦酸二鈉本身無誘導(dǎo)MSC分化為成骨細(xì)胞的功能，也不影響MSC的成骨分化(圖3)。

圖3 帕米膦酸二鈉對MSC體外成骨分化的影響Fig.3Effects of parmidronate on the osteogenic differentiation of MSCs

3 討論

雙磷酸鹽是一類治療骨質(zhì)疏松和腫瘤骨轉(zhuǎn)移的藥物，其主要作用靶點(diǎn)是破骨細(xì)胞。我們觀察了雙磷酸鹽對間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。結(jié)果表明，帕米膦酸二鈉可抑制MSC體外增殖，效應(yīng)呈濃度依賴性，但對誘導(dǎo)條件下堿性磷酸酶活性無影響。在相近濃度下，帕米膦酸二鈉可抑制人骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖，抑制其堿性磷酸酶活性，且可促進(jìn)RANKL分泌，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞遷徙[8]。造成結(jié)果差異的主要原因可能與使用的藥物濃度有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1 μg/mL帕米膦酸二鈉可明顯抑制MSC增殖。為排除細(xì)胞增殖抑制作用，本實(shí)驗(yàn)采用的藥物濃度為0.5 μg/mL。但是，既往文獻(xiàn)中所報(bào)道的藥物濃度為5 μg/mL，是本實(shí)驗(yàn)所用濃度的10倍。此外，鑒于文獻(xiàn)所使用的濃度條件下，帕米膦酸二鈉可抑制細(xì)胞增殖，在最終檢測時間點(diǎn)，藥物處理組細(xì)胞數(shù)量應(yīng)大大低于未處理組，因此，直接測定ALP活性，而不考慮細(xì)胞總數(shù)，不能顯示單個細(xì)胞酶含量。本實(shí)驗(yàn)利用蛋白質(zhì)總量作為參考，以更好地體現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)實(shí)際的酶活性，并發(fā)現(xiàn)無論細(xì)胞培養(yǎng)過程中，或MSC在標(biāo)準(zhǔn)成骨誘導(dǎo)劑作用條件下，加入帕米膦酸二鈉組ALP活性與對照組比較，均無明顯差異，提示至少在該濃度下，帕米膦酸二鈉的確不影響MSC成骨活性。截至目前，雙磷酸鹽抑制細(xì)胞增殖的具體機(jī)制尚不清楚，可能與藥物直接作用有關(guān)[9]。

雙磷酸鹽主要沉積于骨組織，靜脈注射或口服后，外周循環(huán)存在時間短。骨組織中富含MSC和成骨細(xì)胞，沉積過程中這兩種細(xì)胞可能受藥物的直接或間接作用。研究表明，濃度大于1 μg/mL的帕米膦酸二鈉可抑制成骨細(xì)胞增殖及Ⅰ型膠原的合成[10]，濃度達(dá)到2 μg/mL左右，培養(yǎng)時間超過72 h，大量成骨細(xì)胞發(fā)生凋亡[11]。在該濃度下，帕米膦酸二鈉也明顯抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡，提示腫瘤治療劑量與正常細(xì)胞毒性劑量相近。

骨壞死是長期使用雙磷酸鹽的并發(fā)癥之一。本研究結(jié)果顯示，高濃度帕米膦酸二鈉可抑制間充質(zhì)干細(xì)胞增殖。既往研究也證實(shí)，高濃度帕米膦酸二鈉可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡[3-6，9－10]。另外，雙磷酸鹽也可抑制內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞活性[3]。可見，對正常細(xì)胞的毒性作用可能是雙磷酸鹽導(dǎo)致骨壞死的原因之一。雙磷酸鹽沉積于骨組織后代謝緩慢，因此，控制攝入量而非減少攝入時間，可能是減少骨壞死并發(fā)癥的有用措施。

總之，帕米膦酸二鈉可抑制人骨髓MSC增殖，但是，在低濃度條件下，并不影響MSC的成骨分化。本結(jié)果可為預(yù)防帕米膦酸鹽所導(dǎo)致的臨床并發(fā)癥提供參考。

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