溫從吉 傅士博 周仁鵬 王丹茹

皮膚損傷后，纖維組織過度增生會形成增生性瘢痕，表現為隆起的紅色瘢痕，伴有慢性的炎癥反應，嚴重影響外觀，并可引起局部功能受限。增生性瘢痕的生理病理機制尚未完全清楚[1]，缺少有效的治療及預防手段。張力對增生性瘢痕的形成具有重要作用。增生性瘢痕的好發(fā)部位，如前胸部、肩部、肩胛區(qū)部及恥骨弓上方等，均系日?；顒又谐掷m(xù)或間斷地處于張力環(huán)境下[2]。減少創(chuàng)面局部張力，可一定程度上抑制瘢痕增生及病理性瘢痕的復發(fā)[3]。目前，常用的方法有彈力衣、硅膠膜及減張膠布等[4]。但由于動物皮膚與人類存在較大的不同，目前的研究尚缺少有效的增生性瘢痕動物模型，無法在細胞及分子水平進行深入研究。2007年，Aarabi等[5]在小鼠背部皮膚模擬人類皮膚的張力環(huán)境形成了增生性瘢痕，類似于人類瘢痕，并能維持6個月以上。因此，我們研究該動物模型，以驗證該模型的有效性，及其是否可持續(xù)而穩(wěn)定表達增生性瘢痕特征。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

4周齡C57/BL6小鼠(中科院上海動物實驗中心)，20只，體質量28±2 g，隨機分為兩組(n=10)。

1.2 實驗方法

小鼠麻醉下在背部縱向切開2 cm，6-0尼龍線縫合，4 d后拆線。創(chuàng)面以6-0尼龍線安裝牽拉裝置，實驗組于術后第4天開始牽拉，距離2 mm，之后隔天牽拉4 mm，至第14天；對照組安裝后不牽拉(圖1)。

圖1 機械牽拉裝置Fig.1Mechanical traction device

1.3 大體觀察

14 d后拆除裝置，牽引結束后1 d、30 d、60 d、90 d觀察小鼠瘢痕生長情況，包括面積、顏色和質地。

1.4 組織學觀察

牽引后1 d、30 d、60 d切取瘢痕組織，即刻4%多聚甲醛固定，脫水、透明、浸蠟、包埋，于瘢痕最凸起部位橫斷切片(厚度為5 μm)，分別行HE和MASSON染色。

1.5 瘢痕面積測量

瘢痕面積根據瘢痕橫斷面HE染色數字圖像進行測量，隨機選取5個切片標本，采用Image Pro-Plus 6.0軟件進行分析，取平均值。

1.6 瘢痕細胞數目變化及膠原量變化情況

取牽引后1 d、30 d、60 d各時間段HE染色標本，100倍視野下取5個區(qū)域，使用Image Pro Plus 6.0標記，并統計細胞核數目，取平均值(細胞數/區(qū)域)。切片MASSON染色，膠原組織染成藍色，取各時間段組織標本，400倍視野下隨機選取5個區(qū)域，Image Pro Plus 6.0軟件統計膠原比例(創(chuàng)面膠原/正常組織膠原×100%)。

1.7 統計學分析

應用SAS 8.1軟件包進行數據統計學分析和處理，實驗數據以±s表示，不同時間點組間比較采用t檢驗，P0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大體觀及瘢痕面積

通過14 d的機械牽引，小鼠背部創(chuàng)面可見明顯的瘢痕組織(4.09±0.31 mm2)，輕度隆起于皮膚表面，色紅，質硬；牽引后30 d，瘢痕面積(3.5±0.2 mm2)較前縮小(P0.5)，瘢痕周圍新生毛發(fā)組織生長旺盛；牽引后60 d，瘢痕面積(1.52±0.12 mm2)進一步縮小(P0.5)。牽引后90 d，瘢痕部位布滿毛發(fā)，中間隱約可見手術切口，瘢痕面積1.42±0.18 mm2。對照組去除裝置后當天及牽拉后30 d瘢痕面積未見明顯改變(1.50±0.18 mm2vs 1.46±0.19 mm2，P0.5)(圖2、3)。

圖2 大體外觀圖Fig.2Gross images

圖3 瘢痕面積變化趨勢Fig.3The area changes of loaded scars over time

2.2 組織學觀察

實驗組牽引后1 d創(chuàng)面新生表皮明顯增厚，局部增厚的表皮組織向下生長，疑似有毛囊的再生(圖4)，肉膜組織切口處中斷，創(chuàng)面中央新生膠原組織填充，膠原中間布滿細胞，新生組織含新生血管組織較多；牽引后30 d，肉膜組織斷裂，表皮較前明顯變薄，瘢痕中央未見毛囊及皮脂腺等皮膚附屬器，膠原組織與表皮平行，毛細血管組織豐富，細胞數目較前減少，未見明顯的漩渦狀膠原結節(jié)；牽引后60 d，瘢痕組織的面積明顯縮小，但瘢痕中央部分膠原增粗且排列紊亂，兩側被含有毛囊新生組織替代。對照組術后30 d切口下方肉膜組織斷裂，但表皮及真皮組織完全愈合，未見明顯平行于表皮的纖維組織(圖5)。

圖4 牽引后1 d可見新生毛囊(MASSON染色)Fig.4Regenerative hair follicle was observed 1 days after traction by MASSON staining

圖5 組織學圖像Fig.5Histological images

2.3 瘢痕組織細胞數目及膠原變化

牽引后1 d，鏡下見組織內布滿細胞(317±20個/區(qū)域)，膠原纖維主要為細而短的小纖維(0.1±0.02)；牽引后30 d，發(fā)現膠原數量明顯增多，膠原纖維平行皮膚表面，細胞數目(165±13個/區(qū)域)較前明顯較少(P0.5)；牽引后60 d；瘢痕部位細胞數目及膠原含量接近正常皮膚(73±11個/區(qū)域vs 80±10個/區(qū)域，P0.5)(0.95±0.09 vs 1±0.01，P0.5)(圖6)。

3 討論

由于對增生性瘢痕纖維增殖過程的病理機制尚不明了，目前的治療效果不理想。大量證據表明，張力跟增生性瘢痕有著密切聯系[3]，我們在小鼠皮膚創(chuàng)面愈合早期給予機械張力刺激，14 d的持續(xù)牽拉后發(fā)現，形成的瘢痕在外觀和組織學上都符合人增生性瘢痕的特征，且在其后的60 d中可持續(xù)維持增生性瘢痕特征。

正常小鼠的皮膚跟人類皮膚解剖結構相差甚遠，其皮膚松弛，布滿毛發(fā)，創(chuàng)面形成后，皮下肉膜組織牽拉周圍皮膚向創(chuàng)面中央聚攏，促進創(chuàng)面愈合，且愈合后幾乎不留痕跡。因此，必須借助牽拉裝置對老鼠創(chuàng)周皮膚施加張力，才能模擬人類皮膚的張力環(huán)境[6]，促使其形成瘢痕。給予張力刺激的時機是決定瘢痕形成效果的重要因素，如果在創(chuàng)面未完全愈合時，也就是還處于炎癥早期給予張力，會影響創(chuàng)面愈合，只有在重新上皮化即炎癥期后期施加張力才會產生增生性瘢痕，并且持續(xù)牽拉時間必須達到7 d以上才可能形成增生性瘢痕[5]。在持續(xù)牽拉14 d后，我們通過HE及MASSON染色發(fā)現，形成的瘢痕為增生性瘢痕，瘢痕組織內未見有明顯的毛囊及皮脂腺等皮膚附屬器，并且瘢痕組織明顯隆起于正常組織，色紅，質硬，且其后的2個月中瘢痕組織依舊可以維持上述特征。此外，我們還發(fā)現，瘢痕組織面積逐漸縮小，且被含有毛囊的新生組織占據。

哺乳動物的毛囊作為復雜的微型器官，一直被認為是不可再生的。但是，有研究認為，兔子、小鼠皮膚在創(chuàng)傷后，毛囊有完全再生的能力[7]。因為缺乏足夠證據，該觀點一直無法得到廣泛認可。Ito等[8]研究發(fā)現，正常的成年小鼠毛囊缺失后可重新生成，再生的毛囊擁有正常毛囊干細胞，表達毛囊結構分化標志，并產生毛發(fā)，擁有毛囊正常的生長周期。有研究證明，機體免疫作用是創(chuàng)面愈合過程中的重要因素，表皮γδT細胞可以分泌Fgf-7(成纖維生長因子)、Fgf-10和IGF1(胰島素樣生長因子)，對角化細胞的存活、增殖及遷移有著重要作用[9]。Gay等[10]研究發(fā)現，當降低Fgf-7表達時，會減少創(chuàng)面誘導的毛囊再生；相反，當過表達Fgf-7時，新生毛囊則有2～3倍的增加，并且發(fā)現γδT細胞分泌的Fgf－7可引發(fā)wnt的表達，增強了創(chuàng)面成纖維細胞wnt的活性，而激活的成纖維細胞也表達Fgf-7，放大了真皮損傷后的wnt信號，促進皮膚毛囊的再生。但是，人類皮膚真皮嚴重缺少定居γδT細胞，創(chuàng)傷后不能誘導毛囊再生。本實驗中，小鼠的瘢痕組織面積縮小，被含有新生毛囊的正常組織替代，且接近于正常皮膚，驗證了小鼠毛囊可以再生，同時表明毛囊的再生對小鼠的瘢痕修復有著重要作用。

綜上所述，本實驗中的動物模型在術后60 d內可形成增生性瘢痕，且符合人增生性瘢痕特征；但因為創(chuàng)面誘發(fā)毛囊再生，使得瘢痕組織面積縮小，不能長期存在。

[1]Atiyeh BS.Nonsurgical manag ement of hypertrophic scars:evidence-based therapies,standard practices,and emerging methods[J].Aesthetic Plast Surg,2007,31(5):468-492.

[2]Ogawa R.Keloid and hypertrophic scarring may result from a mechanoreceptor or mechanosensitive nociceptor disorder[J].Med Hypotheses,2008,71(4):493-500.

[3]Ogawa R,Akaishi S,Huang C,et al.Clinical applications of basic research that shows reducing skin tension could prevent and treat abnormal scarring:the importance of fasical/subcutaneous tensile reduction sutures and flap surgery for keloid and hypertrophic scar reconstruction[J].J Nippon Med Sch,2011,78(2):68-76.

[4]Al-Attar A,Mess S,Thomassen JM,et al.Keloid pathogenesis and treatment[J].Plast Reconstr Surg,2006,117(1):286-300.

[5]Aarabi S,Bhatt KA,Shi Y,et al.Mechanical load initiates hypertrophic scar formation through decreased cellular apoptosis[J].FASEB J,2007,21(12):3250-3261.

[6]Davidson JM,Yu F,Opalenik SR.Splinting strategies to overcome confounding wound contraction in experimental animal models[J].Adv Wound Care,2013,2(4):142-148.

[7]Breedis C.Regeneration of hair follicles and sebaceous glands from the epithelium of scars in the rabbit[J].Cancer Res,1954,14(8):575-579.

[8]Ito M,Yang Z,Andl T,et al.Wnt-dependent de novo hair follicle regeneration in adult mouse skin after wounding[J].Nature,2007,447(7142):316-320.

[9]Jameson J,Ugarte K,Chen N,et al.A role for skin γδ T cells in wound repair[J].Science,2002,296(5568):747-749.

[10]Gay D,Kwon O,Zhang Z,et al.Fgf9 from dermal γδ T cells induces hair follicle neogenesis after wounding[J].Nat Med,2013,19(7):916-923.