程旺開

(蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241003)

稻草秸稈酶解條件優(yōu)化

程旺開

(蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241003)

以高溫預(yù)處理稻草秸稈為原料，分別進(jìn)行纖維素酶、木聚糖酶單因子和正交試驗(yàn)，探索秸稈適宜工藝條件。結(jié)果表明：在1∶8的酶解固液比條件下，添加纖維素酶15 FPU/g底物和木聚糖酶200 IU/g底物，于50 ℃溫度下酶解48 h，將獲得82.13%的還原糖得率。說明以纖維素酶及木聚糖酶處理稻草秸稈是可行方法之一。

稻草；高溫預(yù)處理；纖維素酶；木聚糖酶；還原糖

隨著工業(yè)化的發(fā)展進(jìn)程，人類長期使用的化石能源將逐漸減少，且在其使用過程中還帶來了嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，探尋清潔、可再生能源已成為研究熱點(diǎn)，其中利用木質(zhì)纖維為原料制備燃料乙醇被認(rèn)為是最有工業(yè)應(yīng)用前景的途徑之一[1-2]。在木質(zhì)纖維燃料乙醇的制備過程中，關(guān)鍵技術(shù)在于將木質(zhì)纖維降解為可發(fā)酵性糖。目前常用的處理方法有生物法、化學(xué)法和物理法[3-4]?；瘜W(xué)處理法特別是酸堿法存在成本高、環(huán)境污染大等缺點(diǎn)；生物處理法存在處理周期長、效率低等不足；而采用物理方法不需要添加如硫酸、石灰或氨水等化學(xué)試劑，減少了中和或回收的成本，同時(shí)對(duì)環(huán)境不會(huì)產(chǎn)生污染，具有環(huán)保性[5-6]。本研究以稻草秸稈木質(zhì)纖維為原料，經(jīng)過適當(dāng)?shù)母邷靥幚砗?，添加木聚糖酶和纖維素酶進(jìn)行酶解，以獲得一定的還原糖供后續(xù)的酒精發(fā)酵，為木質(zhì)纖維生產(chǎn)燃料乙醇提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及儀器

稻草秸稈：晚季梗稻秸稈，取于安徽省當(dāng)涂縣石橋鎮(zhèn)，經(jīng)粉碎，過40目篩子，備用；纖維素酶、木聚糖酶：無錫市酶制劑廠；其他試劑均為分析純。

高溫高壓反應(yīng)釜：煙臺(tái)高新區(qū)科立自控設(shè)備研究所；紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；振蕩數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市瑞爾電器有限公司；電子天平：上海精密科學(xué)儀器公司；臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 稻草秸稈高溫預(yù)處理

用天平稱取稻草秸桿112.5 g倒入高溫高壓反應(yīng)釜中，加水(自來水)900 mL攪拌(固液比為1∶8)，溫度設(shè)置為180 ℃。使溫度盡快升至設(shè)置溫度(因反應(yīng)釜升溫速度較慢，本試驗(yàn)統(tǒng)一設(shè)置為1 ℃/min)，保溫30 min，急劇冷卻至40 ℃左右，打開反應(yīng)釜，將固體和液體一同80 ℃烘干一天，為酶解試驗(yàn)材料。1.2.2 酶解單因素試驗(yàn)

在其他酶解工藝參數(shù)一定的情況下，單獨(dú)考察纖維素酶、木聚糖酶、固液比和酶解時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響，旨在找出各單因素的合適工藝參數(shù)范圍，以便采用正交試驗(yàn)對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。具體酶解單因素試驗(yàn)條件如下：

1)纖維素酶添加量試驗(yàn)：取酶解試驗(yàn)材料0.833 3 g于500 mL三角瓶內(nèi)，用0.1 M乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH=4.8)配制成1∶12的固液比，添加不同的纖維素酶(4、6、8、10、12.5、15、20、30 FPU/g底物)，在50 ℃下酶解48 h后，取2 mL酶解液，離心取上清液測(cè)還原糖，計(jì)算還原糖得率。

2)木聚糖酶添加量試驗(yàn)：取酶解試驗(yàn)材料0.833 3 g于500 mL三角瓶內(nèi)，用0.1 M乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH=4.8)配制成1∶8的固液比，添加10 FPU/g底物的纖維素酶和不同量的木聚糖酶(50、100、150、200、250、300、400 IU/g底物)，在50 ℃下酶解48 h后，取2 mL酶解液，離心取上清液測(cè)還原糖，計(jì)算還原糖得率。

3)酶解固液比試驗(yàn)：取酶解試驗(yàn)材料0.833 3 g于500 mL三角瓶內(nèi)，用0.1 M乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH=4.8)配制成不同的固液比(1∶20、1∶18、1∶16、1∶14、1∶12、1∶10、1∶8、1∶6、1∶4)，添加15 FPU/g底物的纖維素酶和200 IU/g底物的木聚糖酶，在50 ℃下酶解48 h后，取2 mL酶解液，離心取上清液測(cè)還原糖，計(jì)算還原糖得率。

4)酶解時(shí)間試驗(yàn)：取酶解試驗(yàn)材料0.833 3 g于500 mL三角瓶內(nèi)，用0.1 M乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH=4.8)配制成1∶14的固液比，添加15 FPU/g底物的纖維素酶量和200 IU/g底物的木聚糖酶，在50 ℃溫度下酶解不同的時(shí)間后，取2 mL酶解液，離心取上清液測(cè)還原糖，計(jì)算還原糖得率。

1.2.3 酶解正交試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行L2556正交表安排試驗(yàn)(見表1)，以還原糖得率為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝及參數(shù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用《正交設(shè)計(jì)助手IIV3.1版》軟件處理。

表1 酶解正交試驗(yàn)L2556因素水平表

1.3 酶與酶解成分測(cè)定

1.3.1 酶活定義

纖維素酶活力單位(FPU)：酶于50 ℃ 和pH 4.8條件下，每分鐘水解0.5 g濾紙生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)纖維素酶活力單位；

木聚糖酶活力單位(IU)：1 g酶粉(或者1 mL酶液)于50 ℃和pH 4.8條件下，每分鐘分解1%的木聚糖溶液產(chǎn)生1 μmol還原糖(木糖)的酶量定義為1個(gè)木聚糖酶活力單位。

1.3.2 木糖測(cè)定

地衣酚法測(cè)定[7]。

1.3.3 還原糖濃度測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)[8]。

1.3.4 酶解得率的計(jì)算

還原糖得率計(jì)算式為：

式中 M總：稻草秸桿原料的總質(zhì)量(g)；M：稻草秸桿高溫處理后烘干的質(zhì)量(g)；m：酶解物料的質(zhì)量(g)；C：酶解液的還原糖濃度(g/mL)；10：酶解液體積(mL)；0.5914：總糖量/g稻草秸桿。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解單因素試驗(yàn)

2.1.1 纖維素酶添加量

高溫預(yù)處理后稻草秸稈在其他酶解條件一定的情況下，改變不同的纖維素酶添加量，酶解結(jié)束后測(cè)還原糖，計(jì)算還原糖得率。纖維素酶添加量與還原糖得率關(guān)系如圖1所示。

圖1 纖維素酶量對(duì)酶解效果的影響

從圖1可以看出，當(dāng)纖維素酶量太少時(shí)，酶濃度過低，酶解效果不好。還原糖得率隨著酶量的增大而增加，當(dāng)纖維素酶量為15 FPU/g底物時(shí)，還原糖得率達(dá)到45.35%，再增加酶量，還原糖得率趨于穩(wěn)定，因此合適的纖維素酶添加量應(yīng)為15 FPU/g底物。

2.1.2 木聚糖酶添加量

在其他酶解條件一定的情況下，添加不同量的木聚糖酶進(jìn)行酶解。木聚糖酶添加量對(duì)還原糖得率的影響如圖2所示。

圖2 木聚糖酶量對(duì)酶解效果的影響

從圖2可以看出，木聚糖酶的加入提高了還原糖得率，這說明經(jīng)過高溫預(yù)處理的稻草秸稈，其半纖維素受到很大程度的降解，產(chǎn)生了比較多的木聚糖。當(dāng)木聚糖酶添加量為200 IU/g底物時(shí)，還原糖得率達(dá)73.91%，再增加酶量對(duì)酶解沒有多大的影響，因此在該條件下，合適的木聚糖酶添加量應(yīng)為200 IU/g底物。

2.1.3 酶解固液比

將高溫預(yù)處理后的原料配制成不同的固液比，添加15 FPU/g底物的纖維素酶和200 IU/g底物的木聚糖酶，在50 ℃下酶解48 h，考察不同的固液比對(duì)還原糖得率的影響，其結(jié)果如圖3所示。

圖3 固液比(底物濃度)對(duì)酶解效果的影響

從圖3可以看出，當(dāng)?shù)孜餄舛冗^低或過高時(shí)，還原糖得率都降低。當(dāng)?shù)孜餄舛冗^低時(shí)，酶濃度較低，底物與酶接觸的面積少，酶解效率下降；當(dāng)?shù)孜餄舛冗^高時(shí)，酶受到底物的抑制，酶解效果也下降。合適的酶解固液比為1∶8左右，此時(shí)還原糖得率為82.13%。

2.1.4 酶解時(shí)間

高溫預(yù)處理后的稻草秸稈在其他酶解參數(shù)一定的條件下，在不同的酶解時(shí)間內(nèi)測(cè)酶解液中還原糖得率，其變化情況如圖4所示。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

從圖4可以看出，在酶解過程中，酶解速率較強(qiáng)的時(shí)間段為前3 h，當(dāng)酶解時(shí)間到達(dá)24 h后，還原糖得率增加較緩慢，酶解時(shí)間達(dá)48 h后，還原糖得率基本不再增加，這表明酶解已基本結(jié)束。

2.2 酶解正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)(L2556)(見表1)進(jìn)行試驗(yàn)，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正交分析，結(jié)果如表2所示。

表2 酶解正交表(L2556)

續(xù)表2

從表2極差分析看出，各因素對(duì)酶解的影響次序是B>C>D>A，說明在本試驗(yàn)中纖維素酶添加量為最大的限制因素，其次是木聚糖酶添加量，而時(shí)間和固液比影響較小。根據(jù)表2中k值，最適宜的酶解條件為A2B5C5D5，但從k值及效應(yīng)曲線圖(圖5)可以看出，A2B3C3D3和A2B5C5D5很接近，基于節(jié)約成本及縮短酶解時(shí)間，選擇A2B3C3D3為最佳組合，與酶解固液比單因素實(shí)驗(yàn)基本一致，即固液比為1∶8，纖維素酶量為15 FPU/g底物，木聚糖酶量為200 IU/g底物，酶解48 h，還原糖得率為82.13%。

圖5 酶解正交效應(yīng)曲線圖

3 結(jié)論

經(jīng)高溫預(yù)處理后的稻草秸稈，在固液比為1∶8的條件下，添加15 FPU/g底物的纖維素酶和200 IU/g底物的木聚糖酶，于溫度50 ℃和pH 4.8下酶解48 h，將獲得82.13%的還原糖得率。這表明稻草秸稈經(jīng)高溫預(yù)處理后，使其纖維素結(jié)晶區(qū)受到破壞，半纖維素部分得到降解，有利于木聚糖酶和纖維素酶的酶解，因此，采用高溫和酶解的方法能有效將木質(zhì)纖維轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖。

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[責(zé)任編輯：寸曉非]

2014-10-15

安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2013Z345)；蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院項(xiàng)目(Wzyzr201405)

程旺開(1972-)，男，安徽休寧人，蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院副教授，碩士。

S216.2

A

1008-4657(2014)06-0053-06