曹佳 李磊 賀思佳 金晶 吳洪玉 徐雷鳴 李兆申

TM4SF1(transmembrane 4 L six family member 1, 也稱L6,L6-Ag)是4次跨膜蛋白L6超家族成員[1]，在一些上皮來源的腫瘤，如肺癌、卵巢癌、腎癌、前列腺癌等有異常高表達(dá)[2-5]。Kao等[6]報(bào)道，TM4SF1表達(dá)量與肺鱗癌患者的生存期呈正相關(guān)。Gordon等[7]報(bào)道，TM4SF1/PKM2和TM4SF1/ARHGDIA兩組比值與惡性胸膜間皮瘤的術(shù)后預(yù)后相關(guān)。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用基因芯片對(duì)胰腺癌細(xì)胞株的mRNA進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)胰腺癌細(xì)胞株的TM4SF1 mRNA表達(dá)高于人正常胰腺導(dǎo)管細(xì)胞(human pancreatic duct epithelial，HPDE)，提示TM4SF1基因可能與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[8]。本研究旨在進(jìn)一步觀察TM4SF1對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響。

材料與方法

一、細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)材料

MPanc96、MiaPaCa-2、HPAC、PANC1、AsPC-1胰腺癌細(xì)胞系購自ATCC(American Type Culture Collection)。HPDE細(xì)胞株由多倫多大學(xué)Tsao博士贈(zèng)送。MPanc96、MiaPaCa-2、PANC1及AsPC-1細(xì)胞株均在含10%胎牛血清、1%抗生素的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)、傳代；HPAC細(xì)胞株在含10%胎牛血清、1%抗生素的RPMI培養(yǎng)液中培養(yǎng)、傳代；HPDE細(xì)胞株在含牛垂體抽提物及上皮生長因子 的無血清角化細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)、傳代。靶向TM4SF1基因的siRNA(siTM4SF1)及陰性對(duì)照siRNA(siNC)均購自QIAgen公司，siTM4SF1序列為5′-AAGGACCACTATGTCTTGATT-3′。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國QIAgen公司。

二、細(xì)胞TM4SF1 mRNA表達(dá)的檢測

三、胰腺癌細(xì)胞TM4SF1基因表達(dá)的沉默

選取2株高表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞株MPanc96、MiaPaCa-2 的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，分別接種于10 cm的培養(yǎng)皿中，密度為50%～60%，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h。在2個(gè)EP管中分別加入200 μl OPTI MEM、80 μl Hiperfect、8 μl siRNA(10 μmol/L的siTM4SF1或siNC)混勻，放置室溫30 min后分別逐滴滴入孵育1 h的細(xì)胞內(nèi)，繼續(xù)孵育24 h。應(yīng)用qRT-PCR方法驗(yàn)證瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效果。

四、胰腺癌細(xì)胞增殖檢測

取轉(zhuǎn)染的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，采用Promega公司的細(xì)胞增殖檢測試劑盒進(jìn)行檢測。將已轉(zhuǎn)染并孵育24 h的細(xì)胞用胰酶消化，用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×104/ml，接種于96孔板，每孔100 μl。轉(zhuǎn)染siNC及siTM4SF1的細(xì)胞均接種4排，每排6個(gè)復(fù)孔。4排分別在培養(yǎng)0、24、48、72 h時(shí)每孔加入15 μl四唑化合物[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt, MTS]，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，應(yīng)用lQuant通用型96孔板分光光度計(jì)進(jìn)行讀數(shù)。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

五、細(xì)胞遷移與侵襲力檢測

采用裝有Polycarbonate膜的Transwell小室檢測細(xì)胞的遷移力。取轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞，用無血清的DMEM液調(diào)整其密度為2×105/ml。下室加入650 μl含2%胎牛血清的DMEM，上室接種100 μl轉(zhuǎn)染細(xì)胞，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育16～24 h。用棉簽蘸清水擦去膜上層面的細(xì)胞，甲醇固定5 min，Hematoxylin染色3 min。鏡下取8個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染siTM4SF1的細(xì)胞穿膜數(shù)量較轉(zhuǎn)染siNC 細(xì)胞穿膜數(shù)量減少的百分比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

采用裝Matrigel包被膜的Transwell小室檢測細(xì)胞的侵襲力。在上室及下室分別加入500 μl無血清DMEM液后置4℃過夜，棄培養(yǎng)液。上室加100 μl上述的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，下室加650 μl含2%胎牛血清的DMEM液。以下步驟同細(xì)胞遷移力的檢測。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Graphpad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)及Dunnett′s Multiple comparison檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各細(xì)胞株TM4SF1 mRNA的表達(dá)

HPDE細(xì)胞TM4SF1 mRNA表達(dá)量為0.020±0.003，胰腺癌MPanc96、MiaPaCa-2、PANC1、AsPC-1、HPAC細(xì)胞的表達(dá)量分別為1.205±0.073、1.096±0.260、1.382±0.075、1.374±0.363、0.744±0.096，均顯著高于HPDE的表達(dá)量(F=22.26，P<0.01)。

轉(zhuǎn)染siTM4SF1的MPanc96細(xì)胞TM4SF1mRNA表達(dá)量為0.150±0.049，轉(zhuǎn)染siNC的細(xì)胞為0.924±0.162，前者的表達(dá)量下降了83.8%；轉(zhuǎn)染siTM4SF1的MiaPaCa-2細(xì)胞TM4SF1 mRNA表達(dá)量為0.206±0.038，轉(zhuǎn)染siNC的細(xì)胞為0.878±0.119，表達(dá)量下降了76.5%，表明TM4SF1基因的表達(dá)被顯著沉默。

二、TM4SF1基因沉默對(duì)MPanc96、MiaPaCa-2細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染siTM4SF1的MPanc96、MiaPaCa-2細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)染siNC的MPanc96、MiaPaCa-2細(xì)胞的增殖差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U值均=6.000，P值均=0.686，圖1)。

圖1 轉(zhuǎn)染的MPanc96(上)、MiaPaCa-2細(xì)胞(下)的增殖曲線

三、TM4SF1基因沉默對(duì)MPanc96、MiaPaCa-2細(xì)胞遷移及侵襲力的影響

轉(zhuǎn)染siTM4SF1的MPanc96細(xì)胞的遷移力較轉(zhuǎn)染siNC的MPanc96細(xì)胞下降(62.5±7.6)%，侵襲力下降(69.5±5.7)%；轉(zhuǎn)染siTM4SF1的MiaPaCa-2細(xì)胞的遷移力較轉(zhuǎn)染siNC的MiaPaCa-2細(xì)胞下降(72.8±4.0)%，侵襲力下降(78.6±6.3)%(圖2、3)。

圖2 轉(zhuǎn)染siNC(左)和siTM4SF1(右)的MPanc96(上)、MiaPaCa-2(下)穿膜細(xì)胞(遷移力實(shí)驗(yàn)， ×200)

圖3 轉(zhuǎn)染siNC(左)和siTM4SF1(右)的MPanc96(上)、MiaPaCa-2(下)穿膜細(xì)胞(侵襲力實(shí)驗(yàn)， ×200)

討 論

1986年HellstromI等[2]應(yīng)用10 000種單克隆抗體雜交肺癌小鼠的脾臟組織，從而發(fā)現(xiàn)其中14種為肺癌特異性抗體，其中的一種抗原按照當(dāng)時(shí)的編號(hào)命名為L6，同時(shí)發(fā)現(xiàn)這L6在乳腺癌及結(jié)腸癌中也有異常表達(dá)。Marken等[9]研究發(fā)現(xiàn)L6是含有4次跨膜結(jié)構(gòu)的膜蛋白，認(rèn)為L6可能屬于4次跨膜蛋白(Tetraspanins)家族。Wright等[1]發(fā)現(xiàn)L6及另外3種4次跨膜蛋白家族的成員，它們與家族其他成員相比雖具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，但缺乏高度保守的CCG(Cys-Cys-GLy)序列，因此將它們從4次跨膜蛋白家族中細(xì)化出來，命名為4次跨膜蛋白L6超家族，L6蛋白也就被命名為TM4SF1。TM4SF1相對(duì)分子質(zhì)量約21 000，由202個(gè)氨基酸組成。此后在一些上皮來源的腫瘤，如卵巢癌、腎癌、前列腺癌等中均發(fā)現(xiàn)有TM4SF1的異常高表達(dá)[3-5]。2001年Storim等[10]發(fā)現(xiàn)TM4SF1影響表皮角質(zhì)細(xì)胞的體外遷移功能。Chang等[11]報(bào)道，TM4SF1與CD13(aminopeptidase N)相互作用，這種作用可能與肺癌細(xì)胞侵襲前蛋白改變相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，胰腺癌細(xì)胞的TM4SF1mRNA表達(dá)水平明顯高于正常人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞。證實(shí)了前期基因芯片檢測的胰腺癌細(xì)胞TM4SF1表達(dá)增加的結(jié)果，提示TM4SF1基因可能與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展有相關(guān)性。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默胰腺癌細(xì)胞MPanc96、MiaPaCa-2的TM4SF1基因表達(dá)，結(jié)果顯示TM4SF1基因沉默后MPanc96、MiaPaCa-2細(xì)胞的增殖能力無顯著變化，但細(xì)胞的體外遷移及侵襲力顯著下降，推測TM4SF1與胰腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究組將建立胰腺癌原位移植瘤動(dòng)物模型，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證TM4SF1對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。

參 考 文 獻(xiàn)

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