檀巧婷，嚴(yán) 佳，周 欣，宋洪濤 (南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學(xué)科，福建 福州 350025)

快立潔手消毒凝膠是本院自主研發(fā)制劑，臨床上用于外科洗手消毒、手衛(wèi)生消毒以及一般皮膚消毒。根據(jù)《中國藥典》2010年版二部規(guī)定，凝膠劑必須做微生物限度檢查。建立該制劑微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、真菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法是否適合于該制劑的細(xì)菌、真菌及酵母菌數(shù)的測(cè)定[1]。該凝膠中含有三氯生、乙醇等抑菌成分，進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)應(yīng)降低或消除其抑菌作用。經(jīng)查閱相關(guān)資料和文獻(xiàn)[2-6]，對(duì)于抑菌活性強(qiáng)的制劑，微生物限度檢查多采用薄膜過濾法，因此采用薄膜過濾法建立快立潔手消毒凝膠微生物限度檢查方法。

1 試驗(yàn)材料

1.1樣品 快立潔手消毒凝膠(批號(hào)20121112)，由南京軍區(qū)福州總醫(yī)院制劑室提供。

1.2試驗(yàn)菌種 試驗(yàn)用菌均由福建省藥檢所提供，分別是：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]；大腸桿菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]；白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]；黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]；銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(F)10104]。

1.3培養(yǎng)基及稀釋液 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號(hào) 101213)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)110325)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)110401)、改良馬丁培養(yǎng)基(批號(hào)1011282)、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào) 1010272)、膽鹽乳糖培養(yǎng)基(批號(hào)1012012)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)101201)、溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)101124)和pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號(hào) 120329 )均由北京三藥科技開發(fā)公司提供。

1.4儀器 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：GHP-9160)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(型號(hào)：DHG-9145A)、無菌檢查儀(型號(hào)：WJ-6)、凈化工作臺(tái)(型號(hào)：SW-CJ-1B)、真菌培養(yǎng)箱(型號(hào)：MJPS-150)、立式壓力蒸汽滅菌器(型號(hào)：LDZX-40KBS)。

2 驗(yàn)證方法

按照《中國藥典》2010年版二部附錄XI J微生物限度檢查法，進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。

2.1菌液和供試液制備

2.1.1菌液制備 分別取經(jīng)35 ℃培養(yǎng)24 h后的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物，以及26 ℃培養(yǎng)48 h的白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物，用9 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液依次10倍稀釋至10-7；取經(jīng)26 ℃培養(yǎng)7 d后的黑曲霉新鮮培養(yǎng)物，用5 ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，吸出孢子懸液，再10倍遞增稀釋。以上菌懸液同時(shí)取2份注入瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用平皿法計(jì)數(shù)，得到所需菌落數(shù)(50～100 CFU/ml)的菌液稀釋級(jí)。

2.1.2供試液制備 取樣品1 ml，置于100 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，振搖，使其均勻分散，作為1:100供試液，備用。

2.2回收率測(cè)定

2.2.1結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 試驗(yàn)組的菌回收率(%)=[(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)]×100%

稀釋劑對(duì)照組的菌回收率(%)=(稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌數(shù))×100%

2.2.2細(xì)菌、真菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證 ①試驗(yàn)組：取供試液1 ml，注入薄膜過濾器，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液過濾，沖洗3次，每次100 ml，在最后一次的沖洗液中加入試驗(yàn)菌菌懸液1 ml(50～100 CFU/ml)，過濾后取出濾膜，菌面朝上貼于相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)觀察。②菌液組：操作同試驗(yàn)組，僅加菌液。③供試品對(duì)照組：操作同試驗(yàn)組，僅加供試液。④稀釋劑對(duì)照組：取稀釋液1 ml替代供試液，操作同試驗(yàn)組。

表1 細(xì)菌、真菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

由表1可見：回收率均大于70%，結(jié)果符合藥典要求。

2.3控制菌檢查方法的驗(yàn)證[7]

2.3.1試驗(yàn)組 銅綠假單胞菌：取供試液1 ml，注入過濾器中，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液過濾，沖洗3次，在最后一次沖洗液中加入試驗(yàn)菌1 ml(50～100 CFU/ml)，過濾，取出濾膜，接種至100 ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h。取上述培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。金黃色葡萄球菌：同銅綠假單胞菌培養(yǎng)方法，取出濾膜，接種至100 ml的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，取上述培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)72 h，觀察結(jié)果。

2.3.2菌液組 銅綠假單胞菌：過濾器中先注入少量緩沖液，再注入菌懸液各1 ml(50～100 CFU/ml)，不加供試液，過濾(同2.3.1試驗(yàn)組操作)。金黃色葡萄球菌：同上述銅綠假單胞菌培養(yǎng)方法，過濾

后取出濾膜置于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)、劃線(同2.3.1試驗(yàn)組)。

2.3.3供試品對(duì)照組 同試驗(yàn)組，加供試液，不加菌液。

2.3.4稀釋劑對(duì)照組 取與供試液等量的稀釋劑與供試品組同法操作，作為陰性對(duì)照。

表2 控制菌檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1樣品具有抑菌作用，根據(jù)凝膠微生物限度檢查方法的文獻(xiàn)報(bào)道[2-6]，采用薄膜過濾法，能有效降低或消除抑菌作用，檢查結(jié)果符合要求。在驗(yàn)證試驗(yàn)過程中，供試品分別制成1:10，1:20，1:50的供試液時(shí)，薄膜過濾緩慢，濾膜易堵，試驗(yàn)菌生長不規(guī)則，甚至不生長，菌回收率低于70%，不符合藥典要求。試驗(yàn)最終選取1:100供試液，菌落生長良好，薄膜過濾較為順暢，菌回收率均高于70%，驗(yàn)證結(jié)果符合要求。

3.2微生物限度檢查的整個(gè)步驟相當(dāng)復(fù)雜，相關(guān)程序特別多，在檢測(cè)的過程中，任何的檢測(cè)程序中的操作不當(dāng)和硬件條件不夠，都會(huì)對(duì)藥品微生物限度檢查結(jié)果造成不同程度的影響，從而導(dǎo)致誤差的出現(xiàn)[8]。

4 結(jié)論

經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，采用薄膜過濾法對(duì)樣品進(jìn)行細(xì)菌、真菌、酵母菌檢查及控制菌檢查，將樣品制成1:100供試液，用pH 7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 ml，試驗(yàn)菌回收率及控制菌檢查結(jié)果均符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定。因此，在此試驗(yàn)條件下，采用薄膜過濾法建立快立潔手消毒凝膠微生物限度檢查有效可行。

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