肝脂酶基因啟動(dòng)子區(qū)-514C/T多態(tài)性與2型糖尿病 血脂代謝和胰島素抵抗的相關(guān)性研究

石柔，雷又鳴，李會(huì)芳，宋滇平

論著·臨床

肝脂酶基因啟動(dòng)子區(qū)-514C/T多態(tài)性與2型糖尿病 血脂代謝和胰島素抵抗的相關(guān)性研究

石柔，雷又鳴，李會(huì)芳，宋滇平

目的探討肝脂酶(HL)基因啟動(dòng)子區(qū)-514C/T多態(tài)性與2型糖尿病(DM) 血脂代謝和胰島素抵抗(IR)的相關(guān)性。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)結(jié)合DNA測序技術(shù)，對(duì)2型DM患者284例(DM組)和糖耐量正常的健康對(duì)照者197例(NC組)進(jìn)行HL -514C/T多態(tài)性檢測，并觀察該基因多態(tài)性與血脂代謝、IR的相關(guān)性。結(jié)果(1)DM組患者C/C基因型和C/T+T/T基因型頻率分別為39.2%和60.8%，等位基因C和T頻率分別為64.5%和35.5%，NC組分別為32.7%、67.3%和63.2%、36.8%，2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(2)DM組中C/T+T/T基因型患者三酰甘油水平為(2.93±1.37)mmol/L, C/C基因型患者為(2.07±1.82)mmol/L，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),余指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(3)DM組中C/T+T/T基因型患者與C/C基因型患者IR相關(guān)指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(4)Logistic回歸分析表明，DM組中HL-514C/T基因多態(tài)性、BMI與TG異常呈正相關(guān)(OR=3.042，95%CI 1.265～7.317；OR=2.600，95%CI 1.520～4.447，P均<0.05)。結(jié)論HL-514C/T基因多態(tài)性可能與2型DM的發(fā)生無相關(guān)性，與2型DM患者IR亦無關(guān)，但是HL-514T等位基因可能是2型DM患者發(fā)生高TG血癥的危險(xiǎn)因素。

肝脂酶基因；糖尿??；血脂代謝；胰島素抵抗；分子遺傳學(xué)

脂代謝紊亂和胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病(DM)及其并發(fā)癥的原發(fā)性病理生理過程。高脂血癥既是IR的結(jié)果，也是IR的主要致病因素，二者互為因果[1]。肝脂酶(HL)是脂蛋白代謝的關(guān)鍵酶之一，其主要功能是參與高密度脂蛋白的重構(gòu)和乳糜微粒殘骸、低密度脂蛋白的代謝以及膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)。HL基因啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸基因多態(tài)性與HL活性有關(guān)，并影響血脂譜?，F(xiàn)探討HL-514C/T多態(tài)性與2型DM血脂代謝及IR的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2011年3月—2012年11月于我院門診就診或住院2型DM患者284例(DM組)，均符合1999年WHO 2型DM診斷標(biāo)準(zhǔn)；排除標(biāo)準(zhǔn)：急性應(yīng)激狀態(tài)、嚴(yán)重肝臟及腎臟疾病、其他內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等影響血脂代謝的疾病。284例中男146例，女138例，年齡37～75(61.1±10.7)歲，病程(3.6±3.1)年，其中有家族史者68例，無家族史者216例?；颊呔诜堤撬幹委熐抑辽?個(gè)月內(nèi)未使用調(diào)脂藥。選擇同期在我院體檢糖耐量正常且無糖尿病家族史的健康者197例為健康對(duì)照組(NC組)，男102例，女95例，年齡32～72(59.4±11.6)歲。2組均為中國云南地區(qū)居住的無血緣關(guān)系的漢族人。2組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

1.2 觀測方法

1.2.1 臨床及生化指標(biāo)檢測： 記錄2組對(duì)象的性別、年齡、病程、家族史等情況。測量身高、體質(zhì)量、腰圍、臀圍并計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)(BMI)和腰臀比(WHR)。禁食12 h后次日晨采靜脈血3 ml，全自動(dòng)生化分析儀測定空腹血糖(FPG)及餐后2 h血糖(2hPG)、總膽固醇(TC)、三酰甘油 (TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，用微柱法測定糖化血紅蛋白(HbA1c)。用放免法檢測空腹胰島素(FINS)水平，用穩(wěn)態(tài)模型(HOMA)方法，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)：HOMA-IR= (FPG×FINS)/22.5。

1.2.2 HL基因啟動(dòng)子-514C/T多態(tài)性分析： 用酚/氯仿法提取外周血白細(xì)胞DNA作為模版。以寡核苷酸5′-GGATCACCTCTCAATGGGTC-3′為上游引物，5′-GGAAATTCTGCCAAAGGTCGG-3′為下游引物(大連寶生物工程有限公司)進(jìn)行PCR。PCR體系:DNA模板2 μl,10×Buffer(MgC12-Free) 5 μl, MgC12(25 mmol/L)4 μl，DNTP(2.5 mmol/L)1.2 μl，上下游引物(20 μmol/L)各1 μ1，Taq DNA聚合酶(5U/μl) 0.8 μl，加雙蒸水至50 μl。PCR循環(huán)溫度:95℃預(yù)變性5 min，然后按95℃變性45 s、60℃退火45 s、72℃延伸45 s的循環(huán)條件擴(kuò)增，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物以限制性內(nèi)切酶Nla III(大連寶生物工程有限公司) 37℃酶切過夜。酶切產(chǎn)物經(jīng)4 %的瓊脂糖凝膠電泳及溴化乙錠染色后，觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物純化后交由大連寶生物工程有限公司進(jìn)行DNA測序加以確證。

2 結(jié) 果

2.1 HL基因啟動(dòng)子- 514C /T基因型電泳圖譜 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nla III消化后，產(chǎn)生3種酶切結(jié)果：T/T基因型可見241bp的1條片段，C/T基因型可見306bp、241bp 2條片段，C/C基因型只有306bp 1條片段。見圖1。

注：M.Marker；1、2、3.C/C基因型；4.C/T基因型；5.T/T基因型

2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物DNA測序結(jié)果 擴(kuò)增產(chǎn)物片斷為306bp，將產(chǎn)物測序并與GeneBank中HL基因啟動(dòng)子區(qū)-514位點(diǎn)C、T基因系列進(jìn)行比較，與相應(yīng)系列完全一致。見圖2。

2.3 基因型頻率和等位基因頻率比較 對(duì)群體資料作Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)，符合Hardy-Weinberg平衡定律(P均>0.05)；NC組和DM組之間基因型和等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組HL基因型頻率和等位基因頻率

2.4 DM組中HL不同基因型間臨床指標(biāo)比較 DM組中C/T+T/T基因型與C/C基因型攜帶者相比TG升高(P<0.05)，其余指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 DM不同基因型間臨床指標(biāo)比較

注:與C/C基因型比較，aP<0.05

注：A.C/C型；B.C/T型；C.T/T型

2.5 DM組不同HL基因型間胰島素抵抗相關(guān)指標(biāo)比較 盡管C/T+T/T 基因型患者FINS、HOMA-IR 水平較C/C基因型患者高，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 DM不同基因型間胰島素抵抗相關(guān)指標(biāo)比較

2.6 Logistic回歸分析 在DM組中以TG異常與否作為因變量(以TG ≥1.7 mmol/ L為異常)，以HL基因型、性別、年齡、BMI、WHR、FPG、2hPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、TC、HDL-C和LDL-C作為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果提示：DM組中HL-514C/T基因多態(tài)性、BMI與TG異常呈正相關(guān)。見表4。

3 討 論

在2型DM的發(fā)生、發(fā)展過程中常伴隨著不同程度的脂代謝異常。人類肝脂酶是一種重要的脂肪酶，能水解各種脂蛋白內(nèi)的三酰甘油和磷脂，釋放出游離脂肪酸，在乳糜粒殘骸的清除、LDL的形成及TC的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起重要作用。不僅HL的合成和活性異常能引發(fā)血脂異常，而且HL基因啟動(dòng)子區(qū)域多態(tài)性也會(huì)影響其生理功能，從而影響脂代謝[2]。目前大部分的研究都集中在HL- 514C/ T多態(tài)性對(duì)脂代謝的影響上，而針對(duì)糖尿病及其相關(guān)危險(xiǎn)因素的研究較少。

表4 Logistic回歸分析結(jié)果

本研究提示在中國漢族人中HL-514位點(diǎn)存在3種基因型，即C/C型、C/T型和T/T型，T等位基因頻率在DM組和NC組中分別為0.368和0.355。HL- 514C/T基因型及等位基因頻率在DM組與NC組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示HL-514C/T多態(tài)性與2型DM的發(fā)生無相關(guān)性，與大多數(shù)報(bào)道相一致[3，4]。

既往多項(xiàng)臨床研究均表明HL- 514T等位基因與血漿HDL-C及TG的濃度增加有關(guān)[5，6]。最近國內(nèi)外學(xué)者也報(bào)道在男性冠心病患者中，具有HL-514C/T和T/T基因型患者的HDL-C水平明顯高于C/C組，提示該基因多態(tài)性與血脂的關(guān)系可能受性激素水平的影響[5，7]。與此同時(shí)來自美國的一項(xiàng)研究提出不同觀點(diǎn)，他們發(fā)現(xiàn)在肥胖女性中HL-514C/T多態(tài)性獨(dú)立影響HDL-C水平[6]。本研究發(fā)現(xiàn)在DM組中C/T+T/T基因型與C/C基因型攜帶者相比TG升高，但沒有發(fā)現(xiàn)HL-514C/T多態(tài)性與HDL-C有關(guān)。研究結(jié)果的不同，分析其原因可能是HL-514C/T多態(tài)性與脂代謝的關(guān)系受種族、地域、生活方式、性別等多重因素的影響。Logistic回歸分析顯示：HL-514C/T基因多態(tài)性、BMI與TG異常呈正相關(guān)，提示 HL-514T等位基因可能是2型DM患者發(fā)生高TG血癥的遺傳危險(xiǎn)因素。同時(shí)Logistic回歸分析結(jié)果還顯示超質(zhì)量和肥胖可能是2型DM患者發(fā)生高TG血癥的危險(xiǎn)因素，這可能與肥胖引發(fā)IR，而IR又是2型DM和脂代謝紊亂發(fā)生的始動(dòng)因素有關(guān)[8～12]。

由于脂代謝紊亂與IR密切相關(guān)，HL基因多態(tài)性與IR的關(guān)系也開始受到關(guān)注。Yasuyoshi等[13]在日本非糖尿病人群中發(fā)現(xiàn)，HL-514T等位基因攜帶者有較高水平的FINS和HOMA-IR。但本研究發(fā)現(xiàn)，在2型DM患者中，C/T+T/T 基因型患者較C/C基因型患者FINS、HOMA-IR水平升高, 但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示HL-514C/T多態(tài)性與2型糖尿病患者胰島素抵抗無關(guān)。究竟這一多態(tài)性是否與胰島素抵抗相關(guān)需擴(kuò)大樣本量，嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件，進(jìn)一步深入研究。

綜上所述， HL-514C/T基因多態(tài)性可能與2型DM的發(fā)生無相關(guān)性，與2型糖尿病患者胰島素抵抗亦無關(guān)。HL-514T等位基因可能是2型DM患者發(fā)生高TG血癥的危險(xiǎn)因素。但是單一基因的單個(gè)位點(diǎn)變化不足以觀察整個(gè)HL 基因?qū)μ悄虿〉挠绊?，HL-514C/T 多態(tài)性可能不是影響HL活性的惟一因素，將來可對(duì)HL 基因啟動(dòng)子、外顯子多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)一步研究以更好地揭示其與糖尿病的內(nèi)在聯(lián)系。

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Associationofhepaticlipasegenepromoterregion514C/Tpolymorphismwithlipidmetabolismandinsulinresistanceintype2diabetesmellitus

SHIRou*,LEIYouming,LIHuifang,SONGDianping.

*DepartmentofEndocrine,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,China

SONGDianping，E-mail:drsongdp@126.com

ObjectiveTo investigate the correlation among the hepatic lipase (HL) gene promoter 514C/T polymorphism, type 2 diabetes (DM) lipid metabolism and insulin resistance (IR).MethodsApplication the restriction fragment length polymorphism analysis of polymerase chain reaction (PCR-RFLP) combined with DNA sequencing technology, 284 cases of type 2 DM patients (DM group) and normal glucose tolerance in 197 healthy subjects (group NC) were enrolled and underwent for HL-514C/T polymorphism detection, and to observe the correlation between the gene polymorphism, serum lipid metabolism and IR.Results(1) The patients in the DM group with C/C and C/T+T/T genotypes frequencies were 39.2% and 60.8%, C and T allele frequencies were 64.5% and 35.5%, NC group were 32.7%, 67.3% and 63.2%, 36.8%, 2 groups had no significant difference (P>0.05). (2) The patients with C/T+T/T genotype three triglyceride level of DM group was (2.93±1.37) mmol/L, C/C genotype were (2.07±1.82) mmol/L, there was significant difference between the 2 groups (P<0.05), the difference of rest indices were not statistically significant(P>0.05).(3)The differences of rele-vant indices of C/T+T/T genotype and C/C genotype patients' IR were not significantly (P>0.05). (4) Logistic regression analysis showed that, DM group's HL-514C/T gene polymorphisms, BMI were positively correlated with TG anomalies (OR=3.042, 95%CI 1.265-7.317；OR=2.600, 95%CI 1.520-4.447,P<0.05).ConclusionThe HL-514C/T gene polymorphism may had negative correlation with type 2 DM, as well with IR in type 2 DM, while the HL-514T allele may be a risk factor for patients with type 2 DM had high levels of TG.

Hepatic lipase gene; Diabetes; Lipid metabolism; Insulin resistance;Molecular genetics

650032 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌二科(石柔、宋滇平、李會(huì)芳)，干療科(雷又鳴)

宋滇平，E-mail:drsongdp@126.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.07.013

2014-02-19)