缺血預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注自噬的影響

石秋艷，劉冰，張春陽，范亞霞，孫原，楊斌

論著·基礎(chǔ)

缺血預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注自噬的影響

石秋艷，劉冰，張春陽，范亞霞，孫原，楊斌

目的觀察缺血預(yù)處理后不同間隔時間對大鼠腦缺血再灌注海馬自噬的影響。方法參照Zea-Longa線栓法制作大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型，將實驗動物隨機分為3組：假手術(shù)組(Sham組，n=10)、缺血再灌注組(I/R組，n=10)、缺血預(yù)處理組(IPC組，n=30)，缺血預(yù)處理組再按缺血預(yù)處理后不同間隔時間分為1 d、3 d、5 d 3個亞組，每組10只。缺血2 h再灌注24 h后用免疫組織化學(xué)法檢測自噬相關(guān)蛋白BECLIN l、LC3-II的表達情況，透射電鏡觀察神經(jīng)細胞中自噬和溶酶體的激活以及細胞超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果(1)神經(jīng)功能障礙評分：與Sham組比較，I/R組及IPC組均出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能障礙(P<0.01)，IPC組癥狀評分低于I/R組(P<0.05)。(2)腦梗死體積：與Sham組比較，I/R組及IPC組均有不同程度梗死灶(P<0.01)；IPC組腦梗死灶體積明顯低于I/R組(P<0.01)，3 d亞組梗死體積少于1 d、5 d亞組(P<0.01)。(3)免疫組織化學(xué)染色：與Sham組比較，I/R組及IPC組BECLIN l及 LC3-II陽性表達增多(P<0.01)，IPC組陽性表達顯著低于I/R組(P<0.01)，IPC 3 d亞組陽性表達低于1 d、5 d亞組(P<0.01)。(4)腦組織超微病理形態(tài)改變：Sham組細胞正常；I/R組及IPC組可見數(shù)量不等、處于不同時期的自噬體和或自噬溶酶體，線粒體腫脹，膜破裂，可見空泡，各級溶酶體顯著增多，可見變形次級溶酶體，高爾基體分裂；IPC組自噬體及各級溶酶體數(shù)量較I/R組減少，各IPC亞組間自噬體及各級溶酶體數(shù)量無可見變化。結(jié)論缺血預(yù)處理可能通過下調(diào)自噬水平減輕缺血再灌注損傷，缺血預(yù)處理3 d優(yōu)于1 d、5 d。

自噬；缺血預(yù)處理；缺血再灌注損傷；BECLIN l；LC3-II

缺血性腦血管疾病嚴重威脅人類生命和健康，在治療過程中容易發(fā)生缺血再灌注損傷，研究怎樣減輕缺血再灌注損傷具有十分重要的意義。缺血再灌注損傷可導(dǎo)致細胞死亡，過去認為壞死和凋亡是細胞死亡的主要形式，現(xiàn)在一種新的細胞死亡方式——自噬性細胞死亡，越來越受到研究者的重視。缺血預(yù)處理是在缺血再灌注之前，預(yù)先給予組織或器官短暫的間斷缺血，使其能夠增加對隨后長時間缺血再灌注所造成組織或器官損傷的耐受性。缺血預(yù)處理減輕缺血再灌注損傷是通過激發(fā)內(nèi)源性保護機制，但其對腦組織自噬的影響尚無明確的研究結(jié)論。本實驗通過檢測自噬相關(guān)蛋白BECLIN l、LC3-II的表達變化，觀察自噬和溶酶體的激活以及細胞超微結(jié)構(gòu)的變化，探討自噬在缺血預(yù)處理保護作用中的影響，為臨床治療積累更多的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組： 健康成年雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量(250±50)g，清潔級，由河北聯(lián)合大學(xué)實驗動物中心提供，喂養(yǎng)條件如下：5只1籠，室溫22℃，濕度50%～60%，通風(fēng)良好，自由攝食攝水，常規(guī)普通飼料喂養(yǎng)。隨機分為3組：假手術(shù)組(Sham 組，n=10)、缺血再灌注組(I/R 組，n=10)、缺血預(yù)處理組(IPC 組，n=30)，IPC組按照缺血預(yù)處理1 d、3 d、5 d分為3個亞組(n=10)。

1.1.2 實驗材料： 兔抗鼠BECLIN l抗體(bs-1353R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；兔抗鼠LC3-II抗體(bs-4843R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；羊抗兔二抗工作液(SP-9002，中杉金橋)；H-600型透射電鏡；切片機(瑞典LKB公司)；37℃低溫烘箱。

1.2 模型制備 參照Zea-Longa線栓法[1]制備大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型。大鼠術(shù)前禁食12 h，10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，固定頭部及四肢，碘伏消毒皮膚，取頸正中皮膚切口，分離皮下組織及肌肉，暴露右側(cè)頸總動脈，分離迷走神經(jīng)，暴露右側(cè)頸外動脈和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈和頸總動脈，在頸總動脈近分叉處剪一小口，插入0.26～0.30 mm線栓，前進約18～20 mm有阻力感為止，留1 cm線栓在皮膚外，縫合肌肉和皮層，酒精消毒皮膚，術(shù)中保持大鼠直腸溫36～37℃。Sham組不插線栓，余操作相同；I/R組缺血2 h、再灌注24 h；IPC組缺血10 min、再灌注10 min，反復(fù)3次，完成預(yù)處理，分別維持灌注1 d、3 d、5 d，再次缺血2 h、再灌注24 h。

1.3 觀測指標

1.3.1 神經(jīng)功能障礙評分： 參照Zea-Longa神經(jīng)功能障礙評分[1]。0分，無明顯神經(jīng)功能障礙；1分，不能完全伸展左前肢；2分，爬行時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，爬行時向左側(cè)傾倒；4分，無自主活動能力。

1.3.2 氯化三苯基四氮(TTC)染色： 各組隨機選取3只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，快速取腦，-20℃放置10 min，冠狀面均勻切片，2%TTC溶液37℃避光染色30 min，每隔7～8 min用眼科鑷翻轉(zhuǎn)1次，4%多聚甲醛固定24 h，數(shù)碼相機拍照，輸入計算機，圖像分析軟件計算腦梗死體積(紅色區(qū)為正常腦組織，白色區(qū)為梗死腦組織)百分比，即梗死腦組織體積占對側(cè)正常腦組織體積百分比。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色： 各組隨機選取4只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉，經(jīng)左心室先后以生理鹽水和4%多聚甲醛灌注固定，取視交叉后1～5 mm處腦組織，4%多聚甲醛固定24 h以上，常規(guī)石蠟包埋，做5 μm連續(xù)切片備用。切片常規(guī)脫蠟至水；3%H2O2室溫避光10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶；微波或高壓修復(fù)抗原；滴加兔抗鼠BECLIN 1、LC3-II抗體，工作濃度1∶50，4℃過夜；復(fù)溫后滴加羊抗兔二抗工作液，37℃ 1 h；DAB顯色8～12 min；蘇木素復(fù)染2～3 min，分化后充分藍化，脫水透明封片。各步驟之間用PBS緩沖液洗5 min×3次。用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。結(jié)果判定及計數(shù)：BECLIN l、LC3-II陽性細胞胞漿呈棕黃色，核呈藍色；每只動物選取4張切片，光學(xué)顯微鏡高倍鏡(×400)視野下，每張切片觀察5個視野，計數(shù)陽性細胞，取均值。

1.3.4 電鏡標本制作： 各組隨機選取3只大鼠，10%水合氯醛深度麻醉，快速斷頭取腦，分離右側(cè)海馬組織(冰上操作)，取大小約1 mm3組織塊，迅速置入預(yù)冷的4%戊二醛溶液中，4℃保存固定24 h以上，1%鋨酸后固定，丙酮逐級脫水，樹脂包埋，切片機切片，枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察自噬體、溶酶體及細胞超微結(jié)構(gòu)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，以單因素方差分析進行多組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能障礙評分 Sham組未出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，I/R組及IPC組均出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能障礙(P<0.01)，IPC組神經(jīng)功能障礙評分明顯低于I/R組(P<0.05)，IPC各亞組間比較未見顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.2 腦梗死體積計算 Sham組無肉眼可見的梗死灶；I/R組及IPC組均有不同程度梗死灶(P<0.01)；IPC組腦梗死灶體積明顯低于I/R組(P<0.01)，IPC 3 d亞組和1 d、5 d亞組間腦梗死灶體積差異有顯著性意義(P<0.01)，1 d和5 d亞組間腦梗死灶體積差異無顯著性意義(P>0.05)。見表1。

表1 5組再灌注24 h神經(jīng)功能障礙評分、腦梗死體積百分比比較

注：與Sham組比較，aP<0.01；與I/R組比較，bP<0.05，cP<0.01；與1 d、5 d亞組比較，dP<0.01

2.3 免疫組織化學(xué)染色 Sham組只見少量BECLIN l及 LC3-II陽性細胞；I/R組及IPC組均可見大量BECLIN l及 LC3-II陽性細胞(P<0.01)，IPC組BECLIN l及 LC3-II陽性細胞表達顯著低于I/R組(P<0.01)，3 d亞組和1 d、5 d亞組間BECLIN l及LC3-II陽性細胞表達差異有顯著性意義(P<0.01)，1 d和5 d亞組間BECLIN l及LC3-II陽性細胞表達差異無顯著性意義(P>0.05)。見表2，圖1、2見封3。

表2 5組再灌注24 h BECLIN 1、LC3-II陽性細胞數(shù)的比較個/HP)

注：與Sham組比較，aP<0.01；與I/R組比較，bP<0.01；與1 d、5 d亞組比較，cP<0.01

2.4 腦組織超微病理形態(tài)改變 Sham組細胞核膜完整，染色質(zhì)分布均勻，各種細胞器形態(tài)正常，無自噬體出現(xiàn)；I/R組及IPC組可見數(shù)量不等、處于不同時期的自噬體和或自噬溶酶體，線粒體腫脹，膜破裂，可見空泡，各級溶酶體顯著增多，可見變形次級溶酶體，高爾基體分裂；IPC組自噬體及各級溶酶體數(shù)量較I/R組減少，各IPC亞組間自噬體及各級溶酶體數(shù)量無可見變化。圖3見封3。

3 討 論

腦缺血預(yù)處理又稱腦缺血耐受，是指在長時間缺血再灌注之前，給予一次或多次短暫缺血再灌注，使機體產(chǎn)生缺血耐受。1990年，Kitagawa等發(fā)現(xiàn)了腦缺血耐受現(xiàn)象，從此許多學(xué)者開始研究其分子生物學(xué)機制，試圖從中發(fā)現(xiàn)新的神經(jīng)保護途徑。究竟腦缺血耐受現(xiàn)象是如何產(chǎn)生的，關(guān)鍵是給予適宜的缺血預(yù)處理時間和缺血耐受誘導(dǎo)時間。除單循環(huán)缺血預(yù)處理之外，短時間缺血、復(fù)以短時間再灌注，多循環(huán)預(yù)處理方式，可以發(fā)揮更好的保護作用。缺血預(yù)處理對組織或器官的保護作用具有時效性，然而這種時效性由于實驗對象、實驗?zāi)Ｐ图叭毖A(yù)處理方案的不同，有不同的研究結(jié)論[2，3]。本實驗采取缺血10 min/再灌注10 min反復(fù)3次，分別間隔1 d、3 d、5 d再次實施缺血再灌注的預(yù)處理方案，結(jié)果顯示：與Sham組相比，I/R組大鼠出現(xiàn)顯著神經(jīng)功能障礙及腦梗死(P<0.01)，與I/R組比較，IPC組大鼠神經(jīng)功能障礙評分明顯減低(P<0.05，P<0.01)，腦梗死體積明顯縮小(P<0.01)，IPC-3d亞組大鼠腦梗死體積最小(P<0.01)。

細胞通過溶酶體途徑降解衰亡的細胞器及損傷的蛋白即是自噬[4]。適量自噬可使細胞完成自身代謝和細胞器更新，而過量自噬則會造成細胞死亡增多，從而導(dǎo)致病理變化在組織或器官中產(chǎn)生。自噬可被缺血再灌注激活，但自噬究竟是保護細胞還是加速細胞死亡，目前觀點尚未統(tǒng)一，可能取決于疾病發(fā)展的不同階段。哺乳動物細胞中酵母自噬相關(guān)基因 6(Atg6)的同源基因即為BECLIN 1，其對自噬體膜的形成起作用[5]，BECLIN 1被激活可開啟細胞自噬程序，促進自噬溶酶體形成，是自噬啟動的標志，BECLIN 1表達過多可促進自噬發(fā)生[6]。哺乳動物細胞中酵母自噬相關(guān)基因8(Atg8)的同源基因即為LC3，其有I型和II型之分，LC3-I和磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合即可形成LC3-II，其對自噬體的形成具有重要作用，可認為是自噬體形成的標志[7，8]。透射電鏡可準確觀察自噬體形成的不同階段，可見在受損細胞器周圍出現(xiàn)C字型或口杯形雙層膜結(jié)構(gòu)，其延長將受損細胞器包繞，形成自噬體，后被轉(zhuǎn)運至溶酶體，溶酶體將其吞入，形成自噬溶酶體，再將受損細胞器降解。本實驗結(jié)果顯示：與Sham組相比，I/R組BECLIN l、LC3-II陽性細胞表達增多顯著(P<0.01)，可見自噬體和或自噬溶酶體，與I/R組相比，IPC組BECLIN l、LC3-II陽性細胞表達及自噬體和/或自噬溶酶體數(shù)量明顯減少(P<0.01)，IPC 3 d亞組BECLIN l、LC3-II陽性細胞表達最少(P<0.01)。

綜上所述，缺血再灌注使神經(jīng)細胞發(fā)生損傷，并激活自噬，缺血預(yù)處理使BECLIN l、LC3-II蛋白表達下調(diào)產(chǎn)生神經(jīng)保護作用，并且預(yù)處理后3 d作用最強。自噬與缺血預(yù)處理的神經(jīng)保護作用的確切機制及其所涉及的調(diào)控因子，尚需要更多的實驗研究來闡明。

1 胡躍強，唐農(nóng)，董少龍，等．大鼠局灶性腦缺血預(yù)處理后caspase-12mRNA及其蛋白的表達變化[J]．廣東醫(yī)學(xué)，2012，33(6)：739-741．

2 劉樹峰，尹文，虎曉岷.亞低溫聯(lián)合依達拉奉對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用[J].疑難病雜志，2013，12(2)：126.

3 田軍彪，趙見文，張顏偉，等.腦缺血再灌注損傷的中醫(yī)藥實驗研究進展[J].疑難病雜志，2011，10(6)：477.

4 董琳，童煜，毛萌．PC12細胞氧糖剝奪/再灌注損傷中自噬與凋亡現(xiàn)象[J]．實用兒科臨床雜志，2012，27(18)：1397-1401．

5 張蕾，劉衛(wèi)紅，解欣然，等．參元丹含藥血清對心肌缺血保護作用及其微管相關(guān)蛋白及自噬相關(guān)基因表達的影響[J]．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，14(8)：109-113．

6 常健，何斌，朱曉燕，等．缺血再灌注損傷誘導(dǎo)心肌細胞自噬相關(guān)基因過表達[J]．第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2011，32(7)：776-778．

7 蘇方，張培，姜治偉，等．海馬神經(jīng)元缺血/再灌注后自噬的表達及其作用[J]．中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2011，27(2)：187-191．

8 曾斌，王靜文，張玉琳，等．自噬標志性分子LC3B在大鼠全腦缺血復(fù)灌損傷中海馬CA1區(qū)的表達及意義[J]．中國臨床解剖學(xué)雜志，2012，30(6)：667-669．

Influencesofischemicpreconditioningonautophagyinratswithcerebralischemiareperfusioninjury

SHIQiuyan,LIUBing,ZHANGChunyang,FANYaxia，SUNYuan，YANGBin.

DepartmentofNeurology,AffiliatedHospitalofHebeiUnitedUniversity,Tangshan063000,China

ObjectiveTo observe the effect of ischemic preconditioning(IPC) effect on cerebral ischemia reperfusion in rat hippocampus of autophagy.MethodsAccording to method of Zea-Longa filamene, rats middle cerebral artery ischemia-reperfusion model were established, the experimental animal were randomly divided into 3 groups: sham operation group (Sham group,n=10), ischemia reperfusion group (I/R group,n=10), IPC treatment group (IPC group,n=30), in IPC group, according to ischemic preconditioning time, rats were divided into 1 d, 3 d, 5 d subgroups, 10 rats in each group. After ischemia 2 h and reperfusion 24 h, immunohistochemical method was used to detect the autophagy associated protein BECLIN L, LC3-II expression, transmission electron microscope in nerve cell autophagy and lysosomal activation and cell ultrastructure changes.Results(1) Neurological dysfunction score: compared with Sham group, I/R group and IPC group showed varying degrees of nerve dysfunction (P<0.01), I/R group of symptoms in IPC subgroups (P<0.05). (2) The volume of cerebral infarction: compared with Sham group, I/R group and IPC group had different degree of infarction (P<0.01); IPC group was lower than that in I/R group (P<0.01), 3 d subgroup was less than 1 d and 5 d subgroup (P<0.01). (3) Immunohistochemical staining: compared with Sham group, I/R group and IPC group, the number of BECLIN 1 and LC3-II positive cells (P< 0.01), the expression of IPC positive cells was significantly lower than that of I/R group (P< 0.01), IPC 3 d subgroup was less than 1 d, 5 d subgroup (P< 0.01). (4) The change of brain tissue ultrastructure morphology of cells:Sham group was normal; I/R group and IPC group showed varying amounts of autophagy, in different period and or autophagic lysosome, mitochondria swelling, rupture of membranes, vesicles, lysosomes increased significantly,visi-ble deformation of secondary lysosomes,Golgi fragmentation;IPC group autophagy and the number of lysosomes was significantly reduced compared with I/R, the number of the IPC between the subgroups of autophagosomes and lysosomes revealed no visible change.ConclusionIPC may inhibit autophagy relieve the ischemic reperfusion injury,3 d IPC is better than 1 d, 5 d.

Autophagy; Ischemic preconditioning; Ischemia reperfusion injury; BECLIN 1; LC3-II

063000 唐山，河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.07.019

2014-02-18)