劉音吟

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬江蘇省中醫(yī)院,南京 210029)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是引起月經(jīng)失調(diào)、不孕的常見內(nèi)分泌障礙性疾病。PCOS患者經(jīng)藥物等方法糾正排卵后，雖能獲得較高的受孕率，但仍存在低臨床妊娠率、高流產(chǎn)率的現(xiàn)象。筆者在對(duì)PCOS的臨床治療中發(fā)現(xiàn)，促排卵治療結(jié)合泰山磐石散補(bǔ)腎健脾、地屈孕酮健黃體，均能降低早期流產(chǎn)率，減少早期妊娠丟失的發(fā)生。子宮內(nèi)膜容受性是指母體子宮內(nèi)膜處于一種允許胚泡黏附、穿透并植人的狀態(tài)，著床窗口期即是指這段子宮內(nèi)膜容納胚泡植入的時(shí)間[1]。大量研究發(fā)現(xiàn)胚泡著床障礙是導(dǎo)致臨床妊娠率低的主要原因之一,而子宮內(nèi)膜容受性降低又是阻礙胚泡著床的主要因素之一。近年的研究也表明，HOXA10參與胚胎著床的多個(gè)環(huán)節(jié),如子宮內(nèi)膜的增殖與分化、子宮內(nèi)膜容受性的建立、胚胎的定位及黏附等[2]。HOXA10上調(diào)是子宮內(nèi)膜具有容受性的必要條件，可以作為衡量子宮內(nèi)膜接受性的分子標(biāo)志[3]。本研究采用半定量RT-PCR及Western blot法,觀察多囊卵巢綜合征大鼠配合CC促排妊娠后，經(jīng)泰山磐石散、地屈孕酮治療后著床期子宮內(nèi)膜HOXA10mRNA及蛋白的改變，從子宮內(nèi)膜容受性的角度，認(rèn)識(shí)PCOS促排治療后易發(fā)生低臨床妊娠率的可能原因；圍繞內(nèi)膜容受因子HOXA10，探討泰山磐石散、地屈孕酮減少早期妊娠丟失的可能作用機(jī)制，證實(shí)中西藥治療的有效性、可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 21日齡正常健康雌性SD大鼠90只,及80日齡正常健康雄性SD大鼠20只,均由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在12h光照和12h黑暗的條件下喂養(yǎng),環(huán)境溫度22～24 ℃，自由采食和飲水。

1.2 建立PCOS模型及分組 將80只21日齡斷乳雌鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(20只)和PCOS模型組(70只)，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后,于23日齡(實(shí)驗(yàn)第1天)開始。采用Anderson等[4]方法制作DHEA誘導(dǎo)PCOS大鼠模型。PCOS模型組大鼠每日上午定時(shí)頸背部皮下注射DHEA 6 mg/100 g體質(zhì)量+0.2 mL注射用大豆油，對(duì)照組大鼠每日頸背部皮下注射0.2 mL注射用大豆油,連續(xù)30 d。模型組于注射第20天時(shí)開始每天觀察陰道涂片，經(jīng)陰道涂片顯示大鼠始終處于動(dòng)情間期，無動(dòng)情周期變化、無排卵；于第30天PCOS模型組和對(duì)照組全部雌性大鼠，眼眶靜脈采血，模型組血清激素睪酮值升高為造模成功。

1.3 建立正常妊娠模型及PCOS促排妊娠模型 將20只對(duì)照組大鼠自80日齡起以生理鹽水10 mL/kg體質(zhì)量/d，連續(xù)灌胃5 d后與雄鼠按2∶1合籠，次日檢查以發(fā)現(xiàn)陰栓記為妊娠第1天，記為d 1；將對(duì)照組妊娠大鼠作為A組。將70只PCOS模型組大鼠于80日齡起用CC灌胃4.5 mg/kg體質(zhì)量/d，1次/d，連續(xù)5 d促排。促排結(jié)束后，將PCOS促排組與雄鼠按2∶1合籠，次日檢查以發(fā)現(xiàn)陰栓記為妊娠第1天，記為d 1。將PCOS促排妊娠大鼠隨機(jī)分為3組：1)PCOS促排+生理鹽水組(B組)從妊娠d1開始加用0.9%生理鹽水,按10 mL/kg體質(zhì)量/d灌胃，連續(xù)灌胃至處死前；2)PCOS促排+中藥組(C組)，從妊娠d 1開始泰山磐石散顆粒劑(黨參10 g，白術(shù)10 g，白芍12 g，熟地黃10 g，當(dāng)歸8 g，川芎8 g，續(xù)斷15 g，黃芩10 g，炙甘草3 g，砂仁5 g，苧麻根10 g)，按91 mg/kg體質(zhì)量/灌胃，連續(xù)灌胃至處死前；3)PCOS促排+西藥組(D組)，從妊娠d 1開始加用地屈孕酮，按1.8 mg/kg體質(zhì)量/d灌胃，直至處死前。

1.4 制備標(biāo)本 于妊娠d 5分別取A組、B組、C組、D組4組大鼠，每組6只,以頸椎脫臼處死，取雙側(cè)子宮，刮取子宮內(nèi)膜-80 ℃保存?zhèn)溆茫米鱎T-PCR和 Western blot檢測(cè)。

1.5 半定量RT-PCR測(cè)定HOXA10 1)采用美國Invitrogen公司提供的Trizol reagent，按照試劑盒說明從子宮內(nèi)膜中提取總RNA。2)在260 nm下測(cè)定所提取的RNA的紫外吸收OD值，計(jì)算RNA含量。質(zhì)量較好的RNA一般OD260/OD280值為1.6～1.8之間并且在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中可以看出28 S和18 S兩條清晰的帶,且亮度比約為2∶1。將RNA稀釋至OD260為0.010。3)取5 μL RNA，離心管內(nèi)加入oligo(dT)15、5×RT buffer、dNTP、RNA酶抑制劑、無菌水,在反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(美國Promega公司)作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA。4)在genebank里面找到目的基因的全序列(或者mRNA序列)，用Primer5軟件設(shè)計(jì)相關(guān)引物，引物由美國Promega公司提供，見表1。5)以cDNA產(chǎn)物為模板、GAPDH作為內(nèi)參照進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，目的基因退火55 ℃ 35 s，72 ℃ 45 s。6)PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙啶染色后，在凝膠影像分析儀(Bio-Rad ChemiDoc XRS)上進(jìn)行成像，并對(duì)條帶進(jìn)行吸光度分析。計(jì)算待測(cè)基因與GAPDH的比值,從而得到待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)值。

表1 引物序列以及PCR產(chǎn)物大小

1.6 Western blot檢測(cè)HOXA10蛋白表達(dá) 總蛋白提取及蛋白定量:將少量子宮內(nèi)膜組織三去污細(xì)胞裂解液于勻漿器中勻漿。裂解30 min后，在4 ℃下12 000 r/min離心5 min,取上清，用蛋白定量試劑計(jì)算蛋白濃度。樣品加入上樣緩沖液，100 ℃加熱5 min使蛋白變性。Tris-Glycine電泳緩沖液以100 V恒壓凝膠電泳。95 mA，75 min，將分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上轉(zhuǎn)膜。一抗孵育，用PBS-T洗膜2次，使用阻斷劑37 ℃孵育1 h,置于稀釋的特異性抗體反應(yīng)液4 ℃過夜。二抗孵育，用PBS-T洗膜3次,加入含1∶5 000稀釋的過氧化物酶酶聯(lián)二抗反應(yīng)液，37 ℃搖動(dòng)孵育2 h。PBS-T洗膜3次，5 min/次。加ECL-plus發(fā)光顯色液，室溫作用1 min后暗盒曝片。顯影之后根據(jù)Western Blot彩色標(biāo)準(zhǔn)電泳指示條帶的位置，分析所測(cè)電泳條帶的性質(zhì)。電泳條帶經(jīng)Image J軟件處理，分析各實(shí)驗(yàn)組條帶與對(duì)照組條帶面積、灰度比值，進(jìn)一步用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 4組妊娠大鼠種植窗期子宮內(nèi)膜HOXA10 mRNA的表達(dá) 4組妊娠大鼠種植窗期HOXA10 mRNA均有表達(dá)，A組HOXA 10mRNA表達(dá)最高,B組最低。A組、D組中的表達(dá)明顯高于B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C、D組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1，表2。

圖1 4組種植窗期子宮內(nèi)膜HOXA10mRNA的表達(dá)

表2 各組種植窗期子宮內(nèi)膜HOXA1 0mRNA表達(dá)比較

2.2 4組妊娠大鼠種植窗期子宮內(nèi)膜HOXA10蛋白的表達(dá) 各組妊娠大鼠種植窗期HOXA10蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)結(jié)果相似，但組間差異更明顯。A組HOXA10蛋白表達(dá)最高，B組最低。A組中HOXA10的蛋白表達(dá)均高于B、C、D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組中HOXA10的蛋白表達(dá)均低于A、C、D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而C、D組中HOXA10的蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3，圖2。

表3 各組種植窗期子宮內(nèi)膜HOXA10蛋白表達(dá)比較

圖2 4組種植窗期子宮內(nèi)膜HOXA10蛋白的表達(dá)

3 討論

同源框基因(homeobox,HOX)屬于多基因家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因，具有控制胚胎發(fā)育和調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的作用，其中HOXA10基因主要表達(dá)于子宮，HOXA10表達(dá)異常將影響子宮內(nèi)膜的發(fā)育和妊娠。Taylor[5]研究發(fā)現(xiàn),HOXA10在整個(gè)月經(jīng)周期人子宮內(nèi)膜腺上皮和基質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，并在分泌中、晚期表達(dá)達(dá)高峰，而分泌中期正值胚泡植入期。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)[6]，HOXA10-/-小鼠可以存活，但表現(xiàn)為不孕，其能正常排卵并受精，但胚泡不能著床或植入后不久即死亡并被吸收。本研究也表明，PCOS促排妊娠大鼠種植窗期子宮內(nèi)膜HOXA10的表達(dá)明顯低于正常妊娠組，提示PCOS“著床期”子宮內(nèi)膜HOXA10的低表達(dá)，使子宮內(nèi)膜存在潛在缺陷，影響胚泡的著床，這可能也是臨床上PCOS促排治療后高排卵率、低臨床妊娠率、高早期流產(chǎn)率的原因之一。

孕酮是婦女妊娠必不可少的激素，它支持卵巢黃體的功能，使增殖期子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化為分泌期,利于胚胎著床和發(fā)育。喬杰等[7]收集了45例多囊卵巢綜合征不孕癥患者，發(fā)現(xiàn)促排前后有排卵的患者大部分存在黃體功能不足，從而推測(cè)黃體功能不全及間質(zhì)發(fā)育不良是多囊卵巢綜合征高排卵低妊娠率的原因之一。有研究表明，孕激素可通過上調(diào)HOXA10基因促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮和基質(zhì)的分化，使子宮內(nèi)膜從增生期向分泌期轉(zhuǎn)化，利于胚胎著床和發(fā)育[8]。

泰山磐石散出于明代徐春甫所輯《古今醫(yī)統(tǒng)大全》，方中黨參、黃芪補(bǔ)益脾腎之氣；熟地黃、白芍、川芎益腎陰、養(yǎng)陰血；續(xù)斷助腎陽、安胎; 白術(shù)與黃芩健

脾清熱，為安胎要藥，且黃芩又能緩參、芪之溫?zé)?，白術(shù)可防地、芍之滋膩；砂仁理氣醒脾，與白術(shù)相協(xié)使諸藥補(bǔ)而不滯。全方補(bǔ)腎健脾，補(bǔ)氣養(yǎng)血；既滋腎陰，又助腎陽，受孕后能夠安胎，減少早期流產(chǎn)的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，泰山磐石散、地屈孕酮均能上調(diào)PCOS促排妊娠大鼠種植窗期子宮內(nèi)膜HOXA-10表達(dá)，但二者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。泰山磐石散、地屈孕酮可能通過增強(qiáng)內(nèi)膜HOXA10的表達(dá)，改善內(nèi)膜容受不良的狀態(tài)，利于胚胎著床,提高臨床妊娠率、減少早期妊娠丟失。

[1]孫園園,許小鳳.子宮內(nèi)膜容受性中西醫(yī)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].吉林中醫(yī)藥,2013,33(1):102-103.

[2]Benson G V,Lim H,Paria B C,et al.Mechanisms of reduced fertility in Hoxa-10 mutant mice:uterine homeosis andloss of maternal Hoxa-10 expression[J].Development,1996,22(9):2687-2696.

[3]Bagot C N.Kliman H J,Taylor H S.Maternal Hoxal0 is required for pinopod formation in the development of mouse uterine receptivity to embryo implantation[J].Dev Dyn,2001,222(3):538-544.

[4]Anderson E,Lee G Y.Polycystic ovarian condition in the dehydroepi-androsterone treated rat model: hyperandrogenism and the resumption of meiosis are major initial events associated with cystogensis of antral follicles[J].Anat Rec,1997,249(1):44-53.

[5]Taylor H S,Arici A,Olive D,et al.HOXA10 is expressed in response to sex steroids at the time of implantation in the human endometrium[J].JClin Invest,1998,101(7):1379-1384.

[6]Benson G V,Lim H,Paria B C,et al.Mechanisms of reduced fertility in Hoxa-10 mutant mice:uterine homeosis and loss of maternal Hoxa-10 expression[J].Development,1996,122(9):2687-2696.

[7]喬杰,李美芝,李留霞.多囊卵巢綜合征的促排卵治療[J].北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1997,29(2):190-192.

[8]賈詠存,周生建,魏莎莉,等.HOXA10在早孕小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2007,32(12):1260-1264.