王佳烈，馬國(guó)強(qiáng)

論著·基礎(chǔ)

人樹(shù)突狀細(xì)胞與肺癌細(xì)胞A-549融合疫苗生物學(xué) 特性研究

王佳烈，馬國(guó)強(qiáng)

目的探討人樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)與人肺癌細(xì)胞A-549融合所得疫苗在制備過(guò)程中的生物學(xué)特性，總結(jié)高效制備融合疫苗的方法。方法應(yīng)用GM-CSF和IL-4優(yōu)化的方法制備肺癌患者人外周血單核細(xì)胞以獲得DC，尋找DC制備率最高時(shí)間段；同時(shí)應(yīng)用PKH672GL(綠色熒光)和PKH262GL(紅熒光)分別標(biāo)記DC和肺癌細(xì)胞A-549細(xì)胞，篩查最佳的融合比例。結(jié)果應(yīng)用GM-CSF和IL-4優(yōu)化法進(jìn)行DC制備第7天所得百分率為(66.26±5.13)%，高于其他時(shí)間(P<0.05)；通過(guò)對(duì)比不同融合比例DC與人肺癌細(xì)胞A-549，顯示1∶1時(shí)所取得的融合百分率為(35.15±2.16)%，高于其他比例(P<0.05)。結(jié)論在DC制備過(guò)程中制備第7天所得DC百分率最高，應(yīng)選取此時(shí)作為提取DC的最佳時(shí)間；同時(shí)DC與人肺癌細(xì)胞A-549以1∶1比例相融合所得疫苗百分率最高。

人樹(shù)突狀細(xì)胞；人肺癌細(xì)胞A-549；融合；疫苗

肺癌是十分常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，目前的治療方法主要有放療、化療及手術(shù)等多種方式，但治療效果仍不十分理想。細(xì)胞免疫治療是近年來(lái)新興的一種腫瘤治療方式。其主要原理為誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)和自體T細(xì)胞，使其成為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。其中DC作為一種遞呈細(xì)胞，不僅能夠加工和遞呈抗原，還能有效激活T淋巴細(xì)胞使其成為效應(yīng)T細(xì)胞，因此DC在免疫治療中有著十分重要的作用[1]?，F(xiàn)制備人外周血單核細(xì)胞獲得DC以找出其制備的最佳時(shí)段，并通過(guò)標(biāo)記DC與人肺癌細(xì)胞A-549，找出二者的最佳融合比。

1 材料與方法

1.1 材料 應(yīng)用15%胎牛血清(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)50例人肺癌細(xì)胞A-549，納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)過(guò)臨床診斷、影像學(xué)診斷和病理診斷均確診為肺癌患者；尚未進(jìn)行放療、化療或手術(shù)治療；患者生存時(shí)間保守估計(jì)﹥6個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在嚴(yán)重軀體性疾?。怀霈F(xiàn)腦轉(zhuǎn)移；自身或家族內(nèi)存在精神病病史；存在嚴(yán)重智力或認(rèn)知障礙。按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，每組10例；同時(shí)應(yīng)用GM-CSF和IL-4優(yōu)化法培養(yǎng)250份DC，將250份DC同樣按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，每組50份，培養(yǎng)時(shí)間分別為1d、3d、7 d、10d及14 d。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法：將含有15% FCS的RPMI1640培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞株A-549細(xì)胞，用GM-CSF和IL-4優(yōu)化的方法，培養(yǎng)成人外周血單核細(xì)胞，并用TNF-α和PGE2促成熟2d后獲得成熟DC，倒置顯微鏡觀察DC的形態(tài)[2]。

1.2.2 檢測(cè)方法：分別選取A549細(xì)胞和細(xì)胞球置于蓋玻片上進(jìn)行培養(yǎng)，給予其37℃和5% CO2，完成爬片后取出玻片使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，之后使用PBS進(jìn)行潤(rùn)洗，接著用0.3%Triton X-100進(jìn)行透化處理，封閉后以1∶400的比例加入一抗，并置于4℃的冰箱內(nèi)過(guò)夜[3]。第2天，取出玻片，使用PBS洗滌后以1∶500的比例加入二抗，同時(shí)以37℃的溫度在避光條件下孵育1h，再用PBS洗滌，應(yīng)用PKH672GL(綠色熒光)和PKH262GL(紅熒光)分別標(biāo)記DC和肺癌細(xì)胞A-549細(xì)胞。以50%聚乙二醇和10%二甲基亞砜作為融合劑，構(gòu)建融合細(xì)胞，用共聚焦顯微鏡對(duì)融合細(xì)胞照相，并使用流式細(xì)胞儀快速檢測(cè)紅綠雙熒光細(xì)胞所占的百分率代表細(xì)胞融合率[4]。

1.3 觀察項(xiàng)目

1.3.1 DC制備最佳時(shí)間：應(yīng)用GM-CSF和IL-4優(yōu)化的方法對(duì)人外周血單核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，分別于第1天、第3天、第7天、第10天及第14天各培養(yǎng)皿加入MCH-I類分子，在充分震蕩后應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比分析不同時(shí)間DC的制備率。

1.3.2 最佳融合比例：于DC制備最佳時(shí)間采集DC，應(yīng)用PKH672GL染色標(biāo)記，同時(shí)將染色標(biāo)記好的DC與應(yīng)用PKH262GL染色標(biāo)記好的人肺癌細(xì)胞A-549進(jìn)行融合，以二甲基亞砜作為融合劑，應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)融合百分率進(jìn)行分析，對(duì)比分析不同DC與人肺癌細(xì)胞A-549所融合的比例(包括3∶1、2∶1、1∶1、1∶2及1∶3)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用F檢驗(yàn)及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DC制備率最佳時(shí)間 應(yīng)用GM-CSF和IL-4優(yōu)化法進(jìn)行DC制備第1天、第3天、第7天、第10天、第14天制備率分別為(35.51±3.11)%、(46.26±2.7)%、(66.26±5.13)%、(51.18±2.82)%、(41.51±1.38%)。第7天所得百分率高于其他時(shí)間(P<0.05)。

2.2 最佳融合比例 通過(guò)對(duì)比不同融合比例DC與人肺癌細(xì)胞A-549顯示，3∶1、2∶1、1∶2、1∶3、時(shí)融合率分別為(13.62±1.71)%、(21.16±2.61)%、(35.15±2.16)%、(11.78±1.53)%、(30.13±1.93)%。1∶1時(shí)所取得的融合百分率高于其他比例(P<0.05)。

3 討 論

DC是目前所發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原遞呈細(xì)胞之一,其在刺激機(jī)體的免疫反應(yīng)中有著十分重要的作用。DC能表達(dá)高水平的MHC-I、MHC-II類分子及CD80和 CD40等分子，能有效地向T淋巴細(xì)胞遞呈抗原刺激T細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。腫瘤患者體內(nèi)由于缺少DC或存在功能障礙，導(dǎo)致無(wú)法有效遞呈腫瘤抗原，T細(xì)胞免疫激活受阻，致使機(jī)體免疫功能下降甚至消失或是出現(xiàn)免疫耐受，使得腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)。人體內(nèi)DC主要源于骨髓、外周血及臍血。而單核DC與具有抗原性的單核腫瘤細(xì)胞融合就可以產(chǎn)生特異性較強(qiáng)的免疫性抗原。因此尋找誘導(dǎo)癌細(xì)胞增值分化以及致使治療失敗的主要成分就成為了研究的關(guān)鍵。

本研究中，為了防止沒(méi)有經(jīng)過(guò)融合的腫瘤細(xì)胞對(duì)患者產(chǎn)生污染，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選，以便濾出未融合腫瘤細(xì)胞，提高融合DC疫苗的純度。為達(dá)到這個(gè)目的，本次研究使用特異性標(biāo)記體或是帶有特異性標(biāo)志的腫瘤細(xì)胞，通過(guò)在極低濃度條件下使用PKH67GL和PKH26GL標(biāo)記人DC和肺細(xì)胞，這樣就能保證在正常濃度范圍內(nèi)細(xì)胞不會(huì)存在明顯毒性[6]。通過(guò)在共聚焦顯微鏡視野下觀察呈現(xiàn)出紅色和綠色2種熒光的細(xì)胞融合，能夠利于細(xì)胞儀進(jìn)行篩選。使用PKH67-GL和PKH-62GL熒光染料標(biāo)記細(xì)胞，能夠使人源DC與肺部細(xì)胞結(jié)合的DC疫苗更加易于區(qū)分，這種方式不僅簡(jiǎn)便，而且觀察起來(lái)十分直觀、快速，不需要考慮腫瘤細(xì)胞的抗原標(biāo)志就可以方便快捷地篩選融合細(xì)胞?；谶@些特性，其在融合DC疫苗治療肺癌領(lǐng)域內(nèi)得到普遍重視。此次研究使用了一種更加可靠、有效的分離方式來(lái)分離肺癌干細(xì)胞，即在無(wú)血清的條件下通過(guò)使用培養(yǎng)懸浮球的方式來(lái)分離肺癌干細(xì)胞。在這種方法中，向無(wú)血清條件培養(yǎng)基中加入生長(zhǎng)因子，能夠達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞繁殖的同時(shí)保持細(xì)胞未分化狀態(tài)的目的。在這類培養(yǎng)基中，只有腫瘤干細(xì)胞能夠不斷生長(zhǎng)，因此在這個(gè)分離過(guò)程中，能夠大量富集腫瘤干細(xì)胞[7]。這說(shuō)明懸浮球培養(yǎng)的方式能夠有效分離和富集肺癌干細(xì)胞，使得肺癌干細(xì)胞能夠具有更強(qiáng)的更新和繁殖能力，已達(dá)到標(biāo)記肺癌干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。單核腫瘤干細(xì)胞與DC經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)融合就可以產(chǎn)生特異性抗原。

聚乙二醇是最常用的誘導(dǎo)融合劑,其誘導(dǎo)細(xì)胞融合機(jī)制是作用于細(xì)胞膜,相鄰2個(gè)細(xì)胞的胞膜連接部穿通,胞膜融合形成異型核細(xì)胞進(jìn)而通過(guò)有絲分裂將核合二為一,產(chǎn)生雜交子代細(xì)胞。聚乙二醇法融合人外周血DC和人肺癌細(xì)胞株A-549或H-446所獲得的雜交瘤細(xì)胞，既可內(nèi)源性表達(dá)腫瘤抗原,又具DC抗原遞呈能力, 有效地改善腫瘤細(xì)胞上共刺激分子的表達(dá)，誘導(dǎo)特異抗腫瘤細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)[8]。本組通過(guò)運(yùn)用PKH672GL(綠色熒光)和PKH262GL(紅熒光)分別標(biāo)記DC和肺癌細(xì)胞A-549細(xì)胞，并采用聚乙二醇作為誘導(dǎo)融合劑，結(jié)果顯示：應(yīng)用GM-CSF和IL-4優(yōu)化法進(jìn)行DC制備第7天所得百分率高于其他時(shí)間(P<0.05)；通過(guò)對(duì)比不同融合比例DC與人肺癌細(xì)胞A-549顯示，1∶1時(shí)所取得的融合百分率高于其他比例(P<0.05)。因此在制備DC與人肺癌細(xì)胞A-549聯(lián)合疫苗時(shí)應(yīng)選取DC制備的第7天且選取DC與人肺癌細(xì)胞A-549為1∶1。

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有效數(shù)字的確定

VaccineresearchonbiologicalcharacteristicsofhumandendriticcellsandA-549lungcancercellfusion

WANGJialie,MAGuoqiang.

DepartmentofRespiration,theInnerMongoliaAutonomousRegionPeople'sHospital，Hohhot010017,ChinaCorrespondingauthor:MAGuoqiang,E-mail:813812024@qq.com

ObjectiveTo explore the human dendritic cells (DC) and A-549 in human lung cancer cell fusion vaccine in the biological characteristics of the process of preparation, summarize the methods of efficient preparation of fusion vaccine.MethodsBy using of GM-CSF and IL-4 optimization method for preparing patients with lung cancer in human peripheral blood mononuclear cells for DC, DC looking for the highest rate of preparation time; while applying PKH672GL (green fluorescence) and PKH262GL (red fluorescence) and lung cancer cells were labeled DC and A-549 cells, screening the best blend ratio.ResultsApplication of GM-CSF and IL-4 optimization method for the first 7 days resulting percentage was (66.26±5.13)%, higher than at other times (P<0.05) DC preparation; By comparing different fusion the proportion of DC with human lung cancer cell A-549, showing the percentage of fusion was obtained (35.15±2.16)%, higher than the other ratios (P<0.05).ConclusionThe seventh days' percentage of DC is the best in the preparation process of DC, should be selected as optimum extraction time DC; while DC and human lung cancer cell line A-549 with a ratio of 1∶1shows the highest percentage combined vaccine.

Human dendritic cells; Human lung cancer cell A-549; Fusion; Vaccine

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金資助(No.2011MS1179)

010017 呼和浩特，內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸科

馬國(guó)強(qiáng)，E-mail:813812024@qq.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.03.027

2013-11-21)