劉琴，陳芳，楊麗君，王麗平，朱以良，張宜

(解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科，武漢 430070)

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)來(lái)源于脂肪組織，具有自我更新、多向分化潛能、對(duì)自體損傷小、免疫原性弱、自體移植不發(fā)生排斥反應(yīng)等特點(diǎn)，是組織工程中最有應(yīng)用前景的種子細(xì)胞之一，特別是在骨組織再生利用中具有重要的意義[1-3]。兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞是體外研究組織工程以及間充質(zhì)干細(xì)胞分化機(jī)制的常用間充質(zhì)干細(xì)胞之一。但是，如何獲得足量的兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，解決兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增、凍存及建立細(xì)胞庫(kù)等問(wèn)題一直是學(xué)者們研究的重要內(nèi)容。目前，對(duì)于兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增、誘導(dǎo)分化的研究已經(jīng)較為詳盡，而對(duì)于兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞低溫保存、復(fù)蘇方面的研究比較少。因此，本課題以兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對(duì)象，探討低溫保存是否對(duì)兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的體外生長(zhǎng)特性及多向分化潛能產(chǎn)生影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)日本大耳白兔2只，雌雄不限，體重2.5～3.0 kg，由武漢市萬(wàn)千佳興生物科技有限公司提供【SCXY(鄂)2011-0011】，實(shí)驗(yàn)在廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科進(jìn)行【SYXK(鄂)2008-0007】。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合赫爾辛基宣言動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑

DMEM/F12、PBS購(gòu)自Hyclone，F(xiàn)BS購(gòu)自Gibco，MTT、DMSO購(gòu)自Sigma，成脂、成骨誘導(dǎo)試劑盒購(gòu)自Cyagen公司，F(xiàn)ITC-CD90、FITC-CD44、FITC-CD45及相應(yīng)的同型對(duì)照購(gòu)自美國(guó)BD公司，ALP磷酸酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，通用細(xì)胞凍存液購(gòu)自Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

參考文獻(xiàn)[4]。日本大耳白兔以10%的水合氯醛(2 mL/kg)腹腔注射麻醉，固定于手術(shù)臺(tái)上，手術(shù)區(qū)脫毛備皮，1%碘伏、75%醫(yī)用酒精依次消毒，鋪單，取股溝處的脂肪組織，移入超凈臺(tái)上，PBS漂洗3～4次，清除組織中肉眼可見(jiàn)的小血管、筋膜，剪碎至糜狀，將組織塊均勻地鋪在25 cm2玻璃細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。30 min后取出培養(yǎng)瓶，輕柔地加入2～3 mL含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基浸潤(rùn)組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3 d更換培養(yǎng)液，7～8 d時(shí)刮除組織塊。倒置顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察培養(yǎng)的兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)、結(jié)構(gòu)的變化。待細(xì)胞達(dá)到80%～90%左右融合時(shí)用0.25% trypsin-EDTA進(jìn)行1∶3傳代，記為第一代細(xì)胞(P1)。

1.2.2 細(xì)胞免疫表型的流式細(xì)胞分析

0.25% trypsin-EDTA消化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3代細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，每管含5×105個(gè)細(xì)胞，800 r/min、2 min，棄上清，每管加入100 μL PBS重懸細(xì)胞，加入CD90、CD44、CD45抗體和相應(yīng)的同型對(duì)照10 μL，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌2～3次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 細(xì)胞的凍存復(fù)蘇及復(fù)蘇率的檢測(cè)

取經(jīng)形態(tài)學(xué)和細(xì)胞免疫表型鑒定的第3代細(xì)胞，常規(guī)方法消化，收集細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，每支細(xì)胞含量1×106個(gè)，1000 r/min、2 min，去上清后加入通用細(xì)胞凍存液，將凍存管置4℃ 1 h，-20℃ 2 h，再置 -80℃ 過(guò)夜，第2天放入-196℃液氮保存，6個(gè)月后取出凍存管，在37℃水浴箱中快速解凍，接種至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入適量DMEM/F12，6 h后換液，待細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)以1∶3進(jìn)行常規(guī)傳代。同時(shí)取復(fù)蘇后部分細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活力，活率=活細(xì)胞總數(shù) /細(xì)胞總數(shù)×100%，共3次，取3次平均值。

1.2.4 MTT繪制生長(zhǎng)曲線

將實(shí)驗(yàn)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組為凍存6個(gè)月復(fù)蘇后傳至第7代的細(xì)胞(P7)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/mL，接種到96孔板(每孔200 μL)，并設(shè)調(diào)零孔和對(duì)照孔，連續(xù)測(cè)8d；對(duì)照組為未經(jīng)低溫凍存的第7代細(xì)胞，以相同的細(xì)胞密度接種到96孔板。從接種后的第2天起，每天同一時(shí)間取樣，用PBS沖洗1～2次，各滴加50 μL MTT溶液(5g/L)，37℃孵育4 h后吸棄各孔內(nèi)的液體，加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，采用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光值，計(jì)算出各組的均值，以時(shí)間(d)為橫坐標(biāo)，吸收值(A) 為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 細(xì)胞分化潛能的檢測(cè)

根據(jù)成脂、成骨分化誘導(dǎo)試劑盒說(shuō)明書介紹的方法，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別進(jìn)行體外成脂、成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，誘導(dǎo)2周后分別進(jìn)行油紅O染色、茜素紅染色。

1.2.6 ALP 活性測(cè)定

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞分別成骨誘導(dǎo)3、5、7、9、11、13、15、17 d，取每組4孔細(xì)胞，按ALP試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的堿性磷酸酶活性，檢測(cè)結(jié)果單位換算為 U/104個(gè)細(xì)胞。堿性磷酸酶活性為金氏單位/g，換算公式為每克組織蛋白在37℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為一個(gè)金氏單位，參考文獻(xiàn)[5]。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用 SPSS 10.01 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P值< 0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)特性

將組織塊接種到培養(yǎng)瓶2～3 d后，可見(jiàn)少量細(xì)胞從組織塊中爬行出來(lái)，形態(tài)以長(zhǎng)梭形為主，少數(shù)為圓形、多角形。培養(yǎng)3～4 d后，在光鏡下可見(jiàn)更多的細(xì)胞從組織塊中爬行出來(lái)，細(xì)胞大小比較均一，形態(tài)多為典型的長(zhǎng)梭形，見(jiàn)圖1A。12～14 d后，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榫坏拈L(zhǎng)梭形，并達(dá)到80%左右融合，見(jiàn)圖1B。細(xì)胞傳至第3代時(shí)，可見(jiàn)大量成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞呈明顯的漩渦狀生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1C(圖1見(jiàn)彩插9)。

2.2 細(xì)胞免疫表型的分析

流式細(xì)胞儀分析第3代細(xì)胞的細(xì)胞表型，檢測(cè)結(jié)果顯示：培養(yǎng)的細(xì)胞強(qiáng)烈表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志物CD44、CD90，陽(yáng)性率分別達(dá)97.60%、99.96%；低表達(dá)造血干細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志物CD45，陽(yáng)性率低于0.19%，見(jiàn)圖2。表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞是具有均一間充質(zhì)干細(xì)胞表面特征的細(xì)胞群。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞表型

2.3 兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞凍存復(fù)蘇培養(yǎng)觀察

取凍存6個(gè)月的第3代兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇，臺(tái)盼蘭染色后細(xì)胞存活率可達(dá)83%。復(fù)蘇的細(xì)胞6 h內(nèi)貼壁，少許懸浮，貼壁細(xì)胞以長(zhǎng)梭形為主，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，5～6 d達(dá)到80%～90%融合，與凍存前兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在形態(tài)上無(wú)明顯差別，見(jiàn)圖3(彩插9)。傳代后細(xì)胞增殖速度較快，形態(tài)較均一，以長(zhǎng)梭形為主。

2.4 生長(zhǎng)曲線

采用MTT法繪制凍存前后兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，兩組均呈典型的“S”形，接種細(xì)胞經(jīng)2天左右的潛伏期后在第4天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增殖，在第7天進(jìn)入平臺(tái)期，凍存后兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力與凍存前沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞凍存前后細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

2.5 油紅O染色

為鑒定復(fù)蘇兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化能力，取復(fù)蘇后傳代至第7代的細(xì)胞及未凍存的第7代兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，做成細(xì)胞爬片，加入成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)，誘導(dǎo)3～4d后少量細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形逐漸變?yōu)槎嘟切巍⒉灰?guī)則形。誘導(dǎo)5～6 d后胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)少量的脂滴。10～12d時(shí)細(xì)胞形態(tài)以多角形、不規(guī)則形為主，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴。2周時(shí)油紅O染色，兩組細(xì)胞內(nèi)均出現(xiàn)大量紅染顆粒，見(jiàn)圖5(彩插9)。表明凍存復(fù)蘇的兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可被誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞。

2.6 茜素紅染色

為鑒定復(fù)蘇兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化能力，取復(fù)蘇后傳代至第7代的細(xì)胞及未凍存的第7代兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，做成細(xì)胞爬片，加入成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，誘導(dǎo)5～6d后，可見(jiàn)細(xì)胞部分形態(tài)由長(zhǎng)梭形變?yōu)椴灰?guī)則形、類圓形、多角形。10～12d后可見(jiàn)不規(guī)則形、多角形細(xì)胞堆積，呈明顯的簇狀生長(zhǎng)。2周時(shí)小心吸棄誘導(dǎo)培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定后加入茜素紅染色，兩組細(xì)胞均可見(jiàn)桔紅色的鈣結(jié)節(jié)，見(jiàn)圖6(彩插9)。表明復(fù)蘇凍存后的兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可被誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞。

2.7 堿性磷酸酶活性測(cè)定

凍存后兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的堿性磷酸酶表達(dá)活性存在明顯的變化趨勢(shì)。成骨誘導(dǎo)1 d時(shí)即可檢測(cè)到低水平表達(dá)的堿性磷酸酶，3 d后堿性磷酸酶值開(kāi)始持續(xù)增加，13 d左右達(dá)到峰值，之后緩慢下降，與凍存前兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞堿性磷酸酶表達(dá)變化趨勢(shì)無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)圖7。

圖7 凍存前后后兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的堿性磷酸酶活性

3 討論

體外獲得足夠量的、生物學(xué)性狀穩(wěn)定的兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞是其應(yīng)用于骨組織工程[6-8]，以及脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨機(jī)制[9]、成軟骨機(jī)制[10]等研究的先決條件。但兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞隨著傳代時(shí)間的增加，其增殖、分化能力均逐漸下降；另一方面，若同一課題組不同研究者要進(jìn)行長(zhǎng)期的、連續(xù)的實(shí)驗(yàn)，則需重新分離細(xì)胞，浪費(fèi)動(dòng)物和經(jīng)費(fèi)，限制兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的廣泛應(yīng)用。低溫凍存是長(zhǎng)期保存細(xì)胞的重要方法，可在一定程度上彌補(bǔ)以上不足之處。

本實(shí)驗(yàn)采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞狀態(tài)良好，形態(tài)呈典型的成纖維樣。關(guān)于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分子特征，目前尚無(wú)研究發(fā)現(xiàn)它有特異性的細(xì)胞表型標(biāo)志物，并且不同的研究結(jié)果有著不同的說(shuō)法。Gronthos[11]及Gu等[12]認(rèn)為人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CD34。但是，Zuk等[13]和Dominici等[14]的研究結(jié)果與之相反。Yoshimura等[15]認(rèn)為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CD34、CD90，不表達(dá)CD31、CD45、CD106、CD146。而Varma MJ等[16]認(rèn)為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CD34、CD54、CD90、CD105、CD117、HLA-ABC、HLA-DR，陰性表達(dá)CD31、CD45、CD106、CD146、CD166。Lindroos等[17]及Baer等[18]認(rèn)為供體的不均勻性、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離方法與抗體的來(lái)源、抗體的質(zhì)量、檢測(cè)方法的敏感性、細(xì)胞培養(yǎng)的條件、鑒定細(xì)胞的代數(shù)可能是導(dǎo)致研究結(jié)果不一致的原因。實(shí)驗(yàn)選用具有鑒別意義的細(xì)胞表型標(biāo)記物CD90、CD44、CD45作為兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的表型鑒定[19]，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，第3代細(xì)胞高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的表面抗原CD44、CD90，陽(yáng)性率超過(guò)90%；不表達(dá)造血細(xì)胞相關(guān)的表面抗原CD45，陽(yáng)性率低于1%，與文獻(xiàn)[20]報(bào)道的研究結(jié)果基本一致。

二甲基亞砜是細(xì)胞凍存液的主要成分， 是一種重要的滲透型細(xì)胞保護(hù)劑。二甲基亞砜能夠降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，在緩慢降溫過(guò)程中，可使細(xì)胞內(nèi)水分滲出細(xì)胞外，防止細(xì)胞內(nèi)液冰晶形成、滲透壓改變、細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂等導(dǎo)致的損傷。復(fù)蘇時(shí)1～2 min內(nèi)復(fù)溫，可使細(xì)胞外結(jié)晶在短時(shí)間內(nèi)融化，避免細(xì)胞內(nèi)再形成結(jié)晶[21]。將第3代經(jīng)形態(tài)學(xué)及表面抗原鑒定的兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞凍存于液氮中，6個(gè)月后復(fù)蘇，復(fù)蘇率達(dá)83%，復(fù)蘇的細(xì)胞貼壁快，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，5～7 d達(dá)到80%～90%融合，細(xì)胞形態(tài)以長(zhǎng)梭形為主。傳代后，細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線呈典型的“S”形。凍存后細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)曲線與凍存前不存在明顯的差別，表明低溫凍存不會(huì)影響兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的自我更新和增殖能力。

為證實(shí)凍存復(fù)蘇多次傳代后的兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞仍具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化的能力，對(duì)凍存復(fù)蘇傳代至第7代及未凍存的第7代兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分別進(jìn)行成脂、成骨誘導(dǎo)。脂滴是成脂誘導(dǎo)過(guò)程中形成的特異性物質(zhì)。細(xì)胞外基質(zhì)鈣化是骨組織礦化的標(biāo)志，是成骨分化的終末期表現(xiàn)[22]。堿性磷酸酶是成骨過(guò)程中分泌的特異性蛋白質(zhì)，其高表達(dá)是成骨細(xì)胞早期分化的特異性標(biāo)志[23-24]。實(shí)驗(yàn)針對(duì)以上指標(biāo)進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示，成脂誘導(dǎo)的凍存前后的兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞油紅O染色為陽(yáng)性。成骨誘導(dǎo)的凍存前后的兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞茜素紅染色為陽(yáng)性，細(xì)胞堿性磷酸酶活性均隨著時(shí)間的增加明顯升高，且凍存前后細(xì)胞的堿性磷酸酶活性無(wú)顯著差異(P>0.05)，表面凍存復(fù)蘇多次傳代后的兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化的潛能，與報(bào)道的凍存復(fù)蘇多次傳代后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能相符合[25]。

綜上述，低溫凍存可作為長(zhǎng)期保存兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的一種有效方法，凍存復(fù)蘇傳代后的兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞保持著干細(xì)胞的生物活性，具有較強(qiáng)的增殖能力和向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化的能力，為今后建立兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)以及兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在組織工程、疾病、干細(xì)胞分化機(jī)制等領(lǐng)域中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(本文圖1,3,5,6見(jiàn)彩插9。)

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