張艷芬，劉利鵬，趙立健，時(shí)海浪，劉中成

(1.河北大學(xué) 科學(xué)技術(shù)處，河北 保定 071002；2. 河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北 保定 071002)

自1966 年日本學(xué)者Ishizaka 發(fā)現(xiàn)IgE以來，人們已經(jīng)明確IgE是影響變態(tài)反應(yīng)性疾病的關(guān)鍵因子之一，以IgE為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)藥物已經(jīng)成為治療變態(tài)反應(yīng)性疾病藥物研究的熱點(diǎn)[1-2].近年來，人們相繼開發(fā)了抗IgE抗體、抗FcεRIα抗體、IgE分子類似多肽、受體類似物以及依據(jù)抗IgE抗體效應(yīng)部位設(shè)計(jì)的多肽等抑制性小分子和以IgE為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的疫苗，均取得了一定的治療效果[3-4].其中人源化抗IgE單克隆抗體Omalizumab/Xolair 以及Syk抑制劑R112在臨床上取得巨大的成功，證實(shí)了以IgE/FcεRI信號(hào)通路為靶標(biāo)治療變態(tài)反應(yīng)性疾病的可行性[2,5].噬菌體展示技術(shù)(phage display technology，PDT)是利用生物技術(shù)手段將一定長度的隨機(jī)寡核苷酸片斷克隆至特定表達(dá)載體中，表達(dá)產(chǎn)物以融合蛋白的形式表達(dá)于絲狀噬菌體表面.理論上該肽庫含有了該長度的所有可能的氨基酸排列順序，每個(gè)噬菌體或細(xì)胞呈現(xiàn)其中的一種肽段，因而庫容量極大，利于篩選和擴(kuò)增[6].該技術(shù)已經(jīng)成為揭示蛋白之間相互作用的有效工具，在單克隆抗體和先導(dǎo)化合物篩選、疫苗研制、抗原表位分析、受體與配體結(jié)合位點(diǎn)確定、分子間識(shí)別以及肽類新藥開發(fā)等方面得到了廣泛的應(yīng)用[7-9].目前，未見以IgE分子恒定區(qū)Cε3-Cε4為靶標(biāo)進(jìn)行噬菌體肽庫篩選的相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)室在獲得重組Cε3-Cε4蛋白基礎(chǔ)上，以此為靶標(biāo)，利用噬菌體展示隨機(jī)肽庫技術(shù)進(jìn)行篩選，獲得了具有特異性親和力的結(jié)合肽，初步分析該結(jié)合肽可阻止IgE與其受體結(jié)合，該結(jié)果為進(jìn)一步探索結(jié)合肽生物學(xué)功能提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Ph.D.-12TM噬菌體隨機(jī)肽庫(1.0×1013pfu/mL，隨機(jī)多樣性為2.7×109)、-96gⅢ測序引物(NEB公司)；HRP-抗M13單抗(Amersham Pharmaeia公司)；Cε3-Cε4蛋白為本實(shí)驗(yàn)室保存重組蛋白；蛋白胨、瓊脂粉、酵母粉(OXOID公司)；人淋巴瘤IgE(Chemicon公司)；鼠抗人IgE多抗 、FITC標(biāo)記二抗(Sigma公司)；抗His標(biāo)簽抗體(中杉金橋公司)；質(zhì)粒抽提純化試劑盒、DNA提取試劑盒(上海生工公司)；其余均為國產(chǎn)分析純試劑.P7，P20多肽制備及測序均由上海生工公司完成.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 噬菌體隨機(jī)肽庫篩選系統(tǒng)驗(yàn)證

參照NEB公司 Ph.D.-12TM噬菌體隨機(jī)肽庫說明書，以鏈霉親和素作為靶分子，在封阻液(0.1 mol/L NaHCO3(pH8.6)，50 μg/mL BSA )中加入終質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL的鏈霉親和素以結(jié)合BSA中混有的少量生物素.用0.1 mmol/L的生物素(溶于TBS中)洗脫結(jié)合噬菌體.孵育60 min，經(jīng)3輪富集/擴(kuò)增后，于少于100個(gè)噬菌斑的平板上挑取5個(gè)單克隆，提取DNA后，以-96gⅢ測序引物(5′-HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3′)進(jìn)行測序，驗(yàn)證篩選系統(tǒng).

1.2.2 噬菌體隨機(jī)展示肽庫的篩選

參考噬菌體展示肽庫試劑盒說明書，用NaHCO3溶液稀釋Cε3-Cε4蛋白至100 μg/mL，每孔150 μL上述溶液，4 ℃包被過夜.除去包被液，每孔加滿封閉液，4 ℃作用1.5 h.倒掉封閉液，用TBST緩沖液快速洗板6次.用100 μL的TBST緩沖液稀釋4×1010的噬菌體(即10 μL的原始文庫)，然后加到已包被好的板上，室溫溫和搖動(dòng)60 min.除去未結(jié)合噬菌體，TBST緩沖液洗板15次.用游離靶分子溶液100 μg/mL溶于TBS中，從固定靶分子上將結(jié)合的噬菌體競爭性洗脫下來.室溫溫和搖動(dòng)60 min，收集洗脫液，取5 μL進(jìn)行噬菌體滴度測定，剩余的擴(kuò)增、純化后重復(fù)上述步驟，進(jìn)行下一輪篩選.每輪篩選前后均測定噬菌體的滴度.將加入的噬菌體的量計(jì)為投入量，洗脫得到的噬菌體的量計(jì)為回收量，回收率=回收量/投入量.經(jīng)過4輪淘洗，將最終的篩選產(chǎn)物直接進(jìn)行滴度測定，挑取單克隆鑒定篩選到的噬菌體與Cε3-Cε4蛋白結(jié)合特性.

1.2.3 噬菌體展示肽與Cε3-Cε4蛋白的親和力鑒定

用質(zhì)量濃度為100 μg/mL的Cε3-Cε4蛋白 (溶于0.1 mol/L的NaHCO3中，pH8.6)過夜包被酶聯(lián)板，100 μL/孔，同時(shí)每個(gè)待鑒定克隆均設(shè)置空白孔和包被靶分子不加噬菌體單克隆以及帶有His標(biāo)簽的無關(guān)蛋白(本實(shí)驗(yàn)室保存)作為陰性對(duì)照.去除包被液，用TBST洗6次，加滿封閉液，4 ℃濕盒內(nèi)封閉2 h.去除封閉液，TBST洗滌，從第4輪篩選的平皿上隨機(jī)挑取50個(gè)單克隆噬菌體藍(lán)斑，擴(kuò)增、純化后，用TBST稀釋為1×107pfu/μL，向每個(gè)樣品的陰性對(duì)照孔和靶分子包被孔中均加樣100 μL.室溫振蕩孵育2 h，TBST洗滌，加入封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的抗-M13單克隆抗體.每孔加入100 μL稀釋后的抗體，室溫振蕩孵育l h.倒掉溶液，TBST洗滌，每孔加100 μL TMB底物溶液，室溫避光作用30 min左右.每孔加50 μL 2 mol/L的硫酸溶液終止顯色反應(yīng).測OD450，以O(shè)D450值高于陰性對(duì)照3.0倍以上者定為陽性克隆，每組數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，并取均值表示.

1.2.4 ELISA競爭抑制實(shí)驗(yàn)鑒定展示肽與Cε3-Cε4蛋白的結(jié)合

用100 μg/mL的Cε3-Cε4 蛋白(溶于0.1 mol/L的NaHCO3，pH8.6)包被酶聯(lián)板，10 μL/孔，4 ℃密封濕盒中過夜.去除包被液后各孔加滿封閉液，4 ℃濕盒內(nèi)封閉1～2 h.根據(jù)單克隆樣品滴度測定結(jié)果，分別將11種單克隆樣品用TBST稀釋為1×108pfu/μL，加入到包被蛋白的孔內(nèi)，50 μL/孔，然后再加入用TBS稀釋的鼠抗人IgE抗體，50 μL/孔.陰性對(duì)照孔為50 μL/孔噬菌體+50 μL/孔TBS；空白對(duì)照孔為100 μL/孔TBS.37 ℃孵育1 h，加入封閉液稀釋的HRP標(biāo)記抗-M13單克隆抗體，室溫振蕩孵育l h.用TBST洗滌，每孔加100 μL TMB底物溶液，進(jìn)行顯色.測OD450值，按照下式計(jì)算抑制率：抑制率=(未抑制OD值-抑制后OD值)/未抑制OD值×100%.

1.2.5 體外檢測結(jié)合肽抑制IgE 與其受體FcεRIα的結(jié)合

選擇穩(wěn)定表達(dá)人FcεRIα 的RBL-2H3細(xì)胞株為驗(yàn)證細(xì)胞，將對(duì)數(shù)生長期RBL-2H3細(xì)胞，用2.5 μg/mL胰蛋白酶消化，7×103r/min離心30 s收集細(xì)胞，盡棄上清液； PBSS 洗滌，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL；加入人骨髓瘤IgE至終質(zhì)量濃度為50 ng/mL，分別加入結(jié)合肽P7，P20至以下質(zhì)量濃度：0，10，20，40，80，100 μg/mL，冰上孵育 30 min，同時(shí)，設(shè)置PBS及BSA蛋白作為陰性對(duì)照； 離心，棄上清液，PBSS洗滌；加入 FITC標(biāo)記的抗IgE抗體，冰上避光反應(yīng)45 min；離心棄上清液，洗滌 2 次，棄盡洗液，300 μL/樣品 1%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛重懸，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞熒光率.

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)合肽生物學(xué)功能檢測結(jié)果采用兩因素析因設(shè)計(jì)的定量資料方差分析及在此基礎(chǔ)上的兩兩比較，其他結(jié)果采用單因素方差分析加q檢驗(yàn)，用SAS8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 噬菌體隨機(jī)肽庫篩選系統(tǒng)驗(yàn)證

對(duì)所用噬菌體肽庫進(jìn)行驗(yàn)證是結(jié)合肽篩選的前提，隨機(jī)挑選5個(gè)陽性單克隆噬菌體進(jìn)行測序并翻譯，結(jié)果如表1所示，得到的5條鏈霉親和素結(jié)合肽有4條含有His-Pro-Gln氨基酸序列，即HPQ序列，表明本系統(tǒng)符合要求，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn).

2.2 噬菌體的富集

篩選過程中，每次均投入相同量的噬菌體，即2.0×1010pfu.如表2所示，回收噬菌體的滴度由第1輪1.2×104pfu增加到第4輪3.6×106pfu，增加了300倍，回收率也由第1輪的0.6×10-6增至第4輪篩選后的1.8×10-4，表明與Cε3-Cε4蛋白有高親和力的噬菌體克隆得到了有效富集.

表1 噬菌體隨機(jī)肽庫篩選系統(tǒng)驗(yàn)證

表2 隨機(jī)噬菌體短肽庫回收率

2.3 噬菌體單克隆親和力鑒定

經(jīng)4輪篩選后，隨機(jī)挑取藍(lán)斑單克隆噬菌體，利用ELISA對(duì)其親和力進(jìn)行鑒定(圖1).其中P7，P13，P16，P20，P22，P24，P28，P37，P43的OD450平均值均在1.50以上，P4，P6，P9，P10，P26，P30，P34，P40，P47，P50的OD450平均值均在1.07～1.50.空白對(duì)照OD450的平均值為0.195，陰性對(duì)照OD450平均值為0.355，其他31個(gè)單克隆噬菌體OD450平均值低于1.07，未在圖中表示.所以，本實(shí)驗(yàn)共獲得19個(gè)陽性單克隆噬菌體，陽性率為38%.

C.空白孔；N.包被Cε3-Cε4蛋白不加噬菌體單克?。籋.包被帶有His標(biāo)簽的無關(guān)蛋白.圖1 噬菌體單克隆親和力測定結(jié)果Fig.1 Affinity of phage monoclonals to Cε3-Cε4 detected by ELISA

2.4 陽性克隆噬菌體的序列分析

經(jīng)ELISA檢測呈明顯陽性結(jié)果的19個(gè)單克隆樣品抽提DNA，序列測序后翻譯.根據(jù)編碼鏈中噬菌體PIII基因的閱讀框架翻譯出展示外源多肽的氨基酸序列.結(jié)果如表3，所有陽性克隆編碼氨基酸的密碼子均為NNK(N=GA或TC；K=G或T)，與理論序列相一致.19個(gè)陽性克隆編碼了11條氨基酸(表3)，其中P13，P28，P37氨基酸序列相同，P20，P24，P29氨基酸序列相同，而P22與P7及P43氨基酸序列相同，P16和P50氨基酸序列相同，P6，P9氨基酸序列相同，其他沒有完全一致的氨基酸序列.

表3 噬菌體展示肽的氨基酸序列分析

利用DNAman軟件將各短肽的氨基酸序列與IgE高親和受體FcεRIα亞基的氨基酸序列進(jìn)行相似度分析，P20，P24和P29與受體FcεRIα亞基的98～118位aa有50%的相似度.而P7，P22和P43與FcεRIα的157～170位aa有25%的相似度.其他的9條結(jié)合肽盡管有一定的相似度，但位置大都不在FcεRIα亞基的D2區(qū)及W87-E132、Y149-E162區(qū)間內(nèi).

2.5 ELISA競爭抑制實(shí)驗(yàn)

圖2 Cε3-Cε4蛋白結(jié)合肽競爭抑制實(shí)驗(yàn)Fig.2 Analysis of Cε3-Cε4 binding peptidesby competitive inhibition ELISA

選取噬菌體ELISA檢測為陽性的11種噬菌體克隆進(jìn)一步做鼠抗人IgE抗體-Cε3-Cε4蛋白競爭抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示，鼠抗人IgE抗體能不同程度和11種噬菌體克隆競爭與Cε3-Cε4蛋白結(jié)合，其中抑制率最低的是噬菌體克隆P7，P13和P20，抑制率分別為34%，35%，34.8%，其他抑制率在50%左右.表明篩選到的陽性噬菌體多肽P7，P13和P20與Cε3-Cε4蛋白的結(jié)合能力最強(qiáng).

2.6 結(jié)合肽生物學(xué)功能檢測

IgE特異性結(jié)合肽與IgE結(jié)合后可阻止IgE與細(xì)胞表面受體結(jié)合，結(jié)果如圖3所示，隨著結(jié)合肽濃度的增加，細(xì)胞熒光率逐漸減少，呈顯著劑量效應(yīng)，熒光率降低比例與陰性對(duì)照BSA具有顯著性差異，表明結(jié)合肽P7，P20均可與 IgE特異結(jié)合，抑制 IgE與細(xì)胞表面FcεRIα的結(jié)合.

圖3 結(jié)合肽抑制IgE與FcεRIα作用Fig.3 Inhibition of interaction between IgE andFcεRIα by Cε3-Cε4 binding peptides

3 討論

自1988年P(guān)armley等首次對(duì)噬菌體肽庫進(jìn)行有效篩選以來，該技術(shù)諸多環(huán)節(jié)不斷得到優(yōu)化[10].在篩選肽庫中，必須平衡嚴(yán)謹(jǐn)性(stringency)與產(chǎn)量(yield)間的關(guān)系，有必要對(duì)篩選與洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化.雖然在液相中淘選靶分子配體，可通過降低靶分子濃度來提高篩選嚴(yán)格度，但是根據(jù)說明書推薦的初始濃度10 nmol/L，最后幾輪濃度降低至1 nmol/L的方案，結(jié)果不理想.本實(shí)驗(yàn)采用恒定靶分子質(zhì)量濃度100 μg/L，通過延長洗滌時(shí)間與次數(shù)，并且在4 ℃條件下進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，來增加篩選的嚴(yán)格度，結(jié)果是比較理想的.結(jié)合或洗滌緩沖劑中加入去污劑Tween-20能降低噬菌體與靶分子以及封閉劑之間的非特異性作用，一般最初幾輪淘選中用較低體積分?jǐn)?shù)的Tween-20增加洗脫物的滴度，然后逐漸增加Tween-20體積分?jǐn)?shù)(最大可到5%)來增加選擇的嚴(yán)格性[11].本實(shí)驗(yàn)對(duì)前3輪篩選進(jìn)行測序未發(fā)現(xiàn)共同序列，所以進(jìn)行4輪淘選，并逐步增加Tween-20體積分?jǐn)?shù)(0.1%，0.3%，0.5%，0.5%)，獲得了親和力強(qiáng)、特異性好的結(jié)合噬菌體.

另外，結(jié)合和洗脫時(shí)間也是篩選的關(guān)鍵因素，結(jié)合時(shí)間短，易于篩選到快速結(jié)合的小肽；相反，洗脫時(shí)間長，易于篩選到解離速度慢的小肽，所以，可以通過縮短結(jié)合時(shí)間和延長洗脫時(shí)間的方式來提高篩選的嚴(yán)格度.在最后幾輪篩選時(shí)，洗脫可以在2個(gè)階段進(jìn)行：拋棄在短時(shí)間內(nèi)洗脫下來的噬菌體，而將長時(shí)間洗脫下來的噬菌體進(jìn)行下一輪篩選.實(shí)驗(yàn)中用100 μg/mL游離的靶分子溶液將固定靶分子上結(jié)合的噬菌體競爭性洗脫下來.結(jié)合時(shí)間為4 ℃過夜結(jié)合，洗脫時(shí)間為室溫60 min.

IgE 分子與其高親和力受體FcεRI 作用是引發(fā)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的關(guān)鍵步驟，IgE分子重鏈無亞類，由4個(gè)恒定區(qū)(Cε1-Cε4)組成，有文獻(xiàn)證實(shí)，IgE 分子重鏈區(qū)Cε3-Cε4是與FcεRI 作用的關(guān)鍵區(qū)域[12-13].因此，本文未選擇完整IgE分子作為靶蛋白，而是選擇IgE與受體的作用關(guān)鍵區(qū)域作為篩選靶標(biāo)，這將增加結(jié)合肽的特異性，便于下一階段的生物學(xué)功能研究.本實(shí)驗(yàn)篩選得到11條結(jié)合肽序列，搜索GENBANK數(shù)據(jù)庫，所獲得結(jié)合肽序列在一級(jí)結(jié)構(gòu)上與IgE無同源性.Nakamura用IgE高親和受體FcεRI篩選隨機(jī)短肽庫，得到與之結(jié)合的肽序列CXXGPWXXXC，盡管與IgE沒有同源性，但是能夠阻斷IgE與其高親和受體結(jié)合、抑制組胺的釋放[14-15].本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)合肽與其高親和受體FcεRI有一定的相似性，其中LPGAHDPWKVP與受體FcεRIα亞基的98～118位aa有50%的相似度.KMDYLPHSTSQM與FcεRIα 157～170位aa有25%的相似度，說明P7，P20與FcεRIα亞基的同源性幾率較高.通過HEX分子對(duì)接模擬分析短肽與Cε3-Cε4蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，其中P7和P20有2個(gè)相同的對(duì)接位點(diǎn)ARG-342和GLU-472，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也初步證實(shí)了P7和P20可干擾IgE與受體結(jié)合，推測P7和P20具有開發(fā)成治療變態(tài)反應(yīng)性疾病藥物的潛質(zhì)，本文為深入研究IgE結(jié)合肽功能提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

參 考 文 獻(xiàn):

[1] LEUNG D Y M, SAMPSON A, YUNGINGER W, et al. Effect of anti-IgE therapy in patients with peanut allergy [J]. NEJM, 2003, 348: 986-993.

[2] BOCHBER B, SAIN I S. Introduction anti-IgE [J]. J Allergy Clin Immunol, 2005, 29(1): 1-2.

[3] 劉中成，時(shí)海浪，張艷芬，等. 以IgE/FcεRI信號(hào)通路為靶標(biāo)治療變態(tài)反應(yīng)性疾病研究進(jìn)展 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 46(10)： 1161-1166.

LIU Zhongcheng,SHI Hailang,ZHANG Yanfen,et al. Progress in the study of allergic disease drugs targeting on IgE/FcεRI signaling pathway[J].Acta Pharmaceutica Sinica,2011,46(10):1161-1166.

[4] WALLMANN J, PALI-SCH?LL I, JENSEN-JAROLIM E, et al. Anti-Ids in allergy: timeliness of a classic concept [J]. World Allergy Organiz J, 2010, 3:195-201.

[5] ROSSI A B, HERLAAR E, BRASELMANN S, et al. Identification of the Syk kinase inhibitor R112 by a human mast cell screen [J]. J Allergy Clin Immunol, 2006, 118: 749-755.

[6] SMITH G P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface[J]. Science, 1985, 228: 1315-1317.

[7] DEVLIN J J, PANGANIBAN L C, DEVLIN P E, et al. Random peptide libraries: a source of specific protein binding molecules[J]. Science, 1990, 249: 404-406.

[8] FOLGORI A, TAFI R, MEOLA A, et al. A general strategy to identify mimotopes of pathological antigens using only random peptide libraries and human sera[J]. EMBO J, 1994, 13(9): 2236-2243.

[9] YANOFSKY S D, BALDWIN D N, BUTLER J H, et al. High affinity type I interleukin 1 recrptor antagonists discovered by screening recombinant peptide libraries[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93(14): 7381-7386.

[10] PARMLEY S F，SMITH G P.Antibody-selectable filamentous fd Phage vectors:affinity purifieation of target genes[J]. Gene, 1988, 73(2)：305-318.

[11] WRIGHTON N C, FARRELL F X, CHANG R, et al. Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin[J]. Science, 1996, 273: 458-464.

[12] GOUNNI A S，LAMKHIOUED B，OCHIAI K，et al． High-affinity IgE receptor on eosinophils is involved in defence against parasites[J]．Nature， 1994，367: 183-186．

[13] BASU M，HAKIMI J，DHARM E，et al． Purification and characterization of human recombinant IgE-Fc fragments that bind to the human high affinity IgE receptor[J]． Biol Chem，1993，268: 13118-13127．

[14] LIEN S, LOWMAN H B. Therapeutic peptides[J]. Trends in biotechnology, 2003, 21(12) : 556-562.

[15] NAKAMURA G R, STAROVASNIK M A, REYNOLDS M E, et al. A Novel family of hairpin peptides that inhibit IgE activity by binding to the high-affinity IgE receptor[J]. Biochemistry, 2001, 40(33): 9828-35.