周芬芬，吳 湜，徐少華，黃海輝

艱難梭菌（Clostridium difficile）是醫(yī)院獲得感染性腹瀉最主要的病原菌，在抗生素相關(guān)性腹瀉中占20%～30%，而假膜性腸炎則幾乎90%以上均由艱難梭菌所致，統(tǒng)稱為艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）。自2002年起北美和歐洲相繼發(fā)生100多次CDI暴發(fā)流行，主要與高產(chǎn)毒株核糖體型027有關(guān)［1］。當(dāng)前北美仍以核糖體型027為最多見(jiàn)；歐洲2008年之后其他核糖體型如014／020、078等逐漸成為主要流行株［2］。國(guó)內(nèi)近年來(lái)對(duì)CDI亦越來(lái)越重視，Huang等［3］和陳云波等［4］報(bào)道CDI占醫(yī)院感染性腹瀉的9.5%～30.7%，但我國(guó)迄今為止尚未有核糖體型027感染的報(bào)道。

抗菌藥物的應(yīng)用是CDI的最主要危險(xiǎn)因素。艱難梭菌對(duì)多種抗菌藥物耐藥，在核糖體型027等高毒株的廣泛傳播中亦具重要作用［1］。Oka等［5］和Ilchmann等［6］報(bào)道艱難梭菌對(duì)克林霉素和紅霉素的耐藥率超過(guò)80%，對(duì)莫西沙星的耐藥率高達(dá)56%。國(guó)內(nèi)流行株核糖體型017對(duì)紅霉素、莫西沙星、克林霉素等抗菌藥物的耐藥率亦超過(guò)50%［7］。甲硝唑和萬(wàn)古霉素迄今仍為治療CDI的一線藥物［8］，但近期亦有報(bào)道艱難梭菌對(duì)這2種藥物的敏感性有所下降［9］。本課題對(duì)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院5年前后的艱難梭菌臨床分離株耐藥性和核糖體分型的變化進(jìn)行了研究，為制定CDI的防治策略提供參考。

材料與方法

一、材料

（一）菌株來(lái)源 收集2007年8月—2008年7月和2012年8月—2013年7月我院醫(yī)院獲得性腹瀉患者糞便中分別分離到的74株與64株艱難梭菌，經(jīng)革蘭染色及PCR擴(kuò)增gluD基因陽(yáng)性鑒定。剔除重復(fù)菌株。

（二）培養(yǎng)基及抗菌藥物 CCFA（頭孢甲氧噻吩－環(huán)絲氨酸－果糖－瓊脂）選擇培養(yǎng)基為英國(guó)OXIOD公司產(chǎn)品；Brucella瓊脂培養(yǎng)基為美國(guó)BD公司產(chǎn)品；抗菌藥物包括甲硝唑、萬(wàn)古霉素、紅霉素、莫西沙星、夫西地酸、左氧氟沙星、克林霉素、四環(huán)素、利福平和亞胺培南為美國(guó)Sigma－aldrich公司產(chǎn)品。

（三）主要儀器及試劑 細(xì)胞毒素中和試驗(yàn)試劑盒為美國(guó)Techlab公司產(chǎn)品；Concept 400厭氧工作站為英國(guó)Ruskinn公司產(chǎn)品，多重實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction ，PCR）儀 為 美 國(guó)Cepheid公司產(chǎn)品；HotStarTaq Master Mix試劑盒為德國(guó)QIAGEN公司產(chǎn)品。

二、方法

（一）毒素檢測(cè) 采用普通PCR檢測(cè)tcdA基因，多重實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)tcdB、cdtA、cdtB基因。另以細(xì)胞毒中和試驗(yàn)對(duì)毒素B加以確證。

（二）核糖體分型和多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST） 采用 PCR 核糖體分型法［10］對(duì)所有分離到的產(chǎn)毒株進(jìn)行分型。PCR核糖分型圖譜參照英國(guó)公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室厭氧菌參考實(shí)驗(yàn)室 ［Public Health Laboratory Services （PHLS）Anaerobic Reference Unit，Cardiff］標(biāo)準(zhǔn)菌株圖譜（部分）。如圖譜與標(biāo)準(zhǔn)菌株圖譜一致，則按標(biāo)準(zhǔn)株核糖體型命名，例如核糖體型027；反之則以英文字母如 A、B、C、等順序分型［7］。部分菌株采用Stabler等［11］推薦的方法測(cè)定 MLST，以7個(gè)管家基因（adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA、tpi）作 為 目 標(biāo)測(cè)序基因，在www.mlst.net網(wǎng)站上進(jìn)行分析，得出序列型。

（三）抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 按CLSI推薦的瓊脂稀釋法測(cè)定10種抗菌藥物對(duì)艱難梭菌的MIC。藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基采用Brucella瓊脂添加5 mg／L血紅素，1 mg／L維生素K以及5%脫纖維羊血。按CLSI 2011年版M11－A8推薦艱難梭菌瓊脂稀釋法接種菌液為107CFU／mL，接種菌量為104CFU／點(diǎn)［12］。37℃厭氧培養(yǎng)48 h。按 CLSI 2007年版M11－A7以及2013年版M100－S23標(biāo)準(zhǔn)判讀藥敏試驗(yàn)結(jié)果。CLSI無(wú)確切判斷標(biāo)準(zhǔn)藥物的耐藥折點(diǎn)，按文獻(xiàn)［13－14］報(bào)道：萬(wàn)古霉素≥32 mg／L；紅霉素≥8 mg／L；利福平≥4 mg／L；左氧氟沙星≥8 mg／L；夫西地酸＞0.5 mg／L。質(zhì)控菌株為艱難梭菌ATCC700057和脆弱擬桿菌ATCC 25285。對(duì)3類以上不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的抗菌藥物耐藥的菌株為多重耐藥株。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件計(jì)算 MIC50和 MIC90。

結(jié) 果

一、毒素與核糖體分型

2007年8月—2008年7月與2012年8月—2013年7月分別獲得74株與64株艱難梭菌產(chǎn)毒株。5年前分離到的74株菌中，23株僅產(chǎn)B毒素（A－B＋，31.1%），49株產(chǎn) A、B兩種毒素（A＋B＋，66.2%），2株同時(shí)產(chǎn)A、B兩種毒素和二元毒素（A＋B＋CDT＋，2.7%）。74株菌分別屬于18個(gè)核糖體型，以核糖體型017（A－B＋，24.3%）最為常見(jiàn)。5年后的64株臨床分離株中，22株為A－B＋，占34.4%；42株為A＋B＋，占65.6%。共檢測(cè)到18個(gè)核糖體型，以核糖體型 H（A－B＋，18.8%）最為常見(jiàn)，其次為核糖體型017和012，見(jiàn)表1。H型菌株MLST結(jié)果為ST－81型。

二、藥敏試驗(yàn)分析

138株艱難梭菌對(duì)抗菌藥物的敏感性見(jiàn)表2。所有菌株對(duì)甲硝唑和萬(wàn)古霉素均呈高度敏感。2012—2013年臨床分離株中，分別有26.6%、67.2%、65.6%和28.1%的菌株對(duì)莫西沙星（MIC≥32 mg／L）、紅霉素（MIC＞128 mg／L）、克林霉素（MIC＞128 mg／L）和四環(huán)素（MIC≥32 mg／L）呈高度耐藥；32.8%（21／64）的菌株同時(shí)對(duì)紅霉素、克林霉素、莫西沙星和四環(huán)素呈多重耐藥，其中81.0%（17／21）的多重耐藥菌株屬于核糖體 H型（12／21）和017型（5／21）。與5年前相比，艱難梭菌臨床分離株對(duì)克林霉素耐藥率由74.3%升至84.4%、對(duì)四環(huán)素由39.2%升至48.4%、對(duì)夫西地酸由25.7%升至35.9%，耐藥率呈升高趨勢(shì)，并出現(xiàn)了亞胺培南耐藥株；但對(duì)左氧氟沙星和利福平的耐藥率則出現(xiàn)下降趨勢(shì)，分別由78.4%和20.3%降至47.4和7.8%。同時(shí)5年后多重耐藥株（32.8%）的比率亦高于5年前（28.3%）。

表1 艱難梭菌臨床分離株5年前后的毒素類別及核糖體分型Table 1 Ribotypes and toxin profiles of clinical Clostridium difficile isolates during two periods with an interval of 5 years

表2 比較10種抗菌藥物對(duì)艱難梭菌5年前后臨床分離株的最低抑菌濃度Table 2 Minimum inhibitory concentrations（MICs）of 10 antimicrobial agents against the Clostridium difficile isolates during two periods with an interval of 5 years

討 論

雖然A＋B＋菌株在艱難梭菌感染中仍占主導(dǎo)地位，但是A－B＋菌株感染的報(bào)道亦非少見(jiàn)。歐洲和美國(guó)艱難梭菌臨床分離株仍以A＋B＋菌株為主，A－B＋菌株總分離率為1%～3%［2，15］；但日本和韓國(guó)的艱難梭菌A－B＋產(chǎn)毒株臨床分離率則上升至12.7%～21.4%［16－17］，我 國(guó)陳云 波等［4］和章黎華等［18］報(bào)道A－B＋產(chǎn)毒株占所有分離產(chǎn)毒株的34.0%～37.5%。亞洲國(guó)家A－B＋菌株的分離率明顯高于歐美國(guó)家，有可能與核糖體型017（A－B＋）菌株在亞洲國(guó)家的流行有關(guān)［2，7，15］。本研究中臨床分離株雖然總體來(lái)說(shuō)以A＋B＋菌株為多見(jiàn)，但A－B＋菌株亦約占30%，與陳云波等［4］報(bào)道相仿。因此在國(guó)內(nèi)醫(yī)院的檢驗(yàn)科若僅檢測(cè)A毒素將有約1／3 CDI患者可能漏診。

盡管核糖體型027菌株過(guò)去數(shù)年中在北美與歐洲廣泛流行，但是亞洲的相關(guān)報(bào)道仍比較少，僅韓國(guó)、新加坡、日本與我國(guó)香港有零星報(bào)道。另一新流行株核糖體型078，在荷蘭2005—2008年其分離率從3%迅速增長(zhǎng)到13%，但本研究并未檢測(cè)到。我院2007年8月—2008年7月艱難梭菌臨床分離株以核糖體型017為主，5年后則以H型最多見(jiàn)，占18.8%。H型菌株MLST分型為ST－81型，與核糖體017型／ST－37具有較高的同源性［11］，且兩者的毒素類別均為A－B＋。2012年上海中山醫(yī)院曾在腹瀉伴血流感染患者的糞便和血液中均分離到艱難梭菌，經(jīng)檢測(cè)這2株菌核糖體分型同為H型，提示該型菌株不僅導(dǎo)致腹瀉，而且能引起更為嚴(yán)重且罕見(jiàn)的血流感染。

甲硝唑和萬(wàn)古霉素體外對(duì)艱難梭菌具有良好抗菌活性，耐藥株罕見(jiàn)。然而2008年P(guān)eláez等［19］報(bào)道西班牙一所醫(yī)院艱難梭菌臨床分離株中12%菌株對(duì)甲硝唑呈異質(zhì)性耐藥，本課題組在前期也有類似報(bào)道［20］。但2012—2013年并未在分離到的新鮮菌株中檢測(cè)到異質(zhì)性耐藥菌。與5年前相比，當(dāng)前艱難梭菌臨床分離株對(duì)多種抗菌藥物的耐藥率有所增高，其中對(duì)克林霉素、四環(huán)素、夫西地酸的耐藥率約增高10個(gè)百分點(diǎn)，且對(duì)紅霉素、克林霉素、莫西沙星和四環(huán)素耐藥的多重耐藥菌的比率亦上升至32.8%。耐藥率的升高原因之一可能與近2年核糖體型017和 H型在醫(yī)院內(nèi)的流行相關(guān)（20／64，31.3%），因這2種類型的細(xì)菌多呈多重耐藥；其次可能與抗生素選擇性壓力有關(guān)［21－22］，例如2007年我院多西環(huán)素和亞胺培南－西司他丁的用量分別為200DDDs和2 205.5DDDs，至2012年分別上升至2 896DDDs和3 675.8DDDs。

近10年來(lái)，艱難梭菌作為一種條件致病菌在感染性疾病中的重要性日漸增加。應(yīng)重視CDI的檢測(cè)，建議對(duì)急性醫(yī)院獲得性腹瀉患者，特別是近3個(gè)月內(nèi)曾經(jīng)接受過(guò)抗菌藥物治療者送檢糞便標(biāo)本，一旦確診應(yīng)立即隔離診治，并合理應(yīng)用抗菌藥物，嚴(yán)格掌握適應(yīng)證，避免盲目使用廣譜抗菌藥物對(duì)于降低艱難梭菌感染的發(fā)病和傳播亦極為重要。

［1］ Kelly CP，LaMont JT.Clostridium difficile－more difficult than ever［J］.N Engl J Med，2008，359（18）：1932－1940.

［2］ Bauer MP，Notermans DW，van Benthem BH，et al.Clostridium difficile infection in Europe：a hospital－based survey［J］.Lancet，2011，377（9759）：63－73.

［3］ Huang H，Wu S，Wang M，et al.Molecular and clinical characteristics of Clostridium difficile infection in a University Hospital in Shanghai，China［J］.Clin Infect Dis，2008，47（12）：1606－1608.

［4］ 陳云波，吳微珍，魯海峰，等.艱難梭菌相關(guān)性腹瀉患者50例臨床特征及其病原菌耐藥性分析［J］.浙江醫(yī)學(xué)，2010，32（11）：1632－1634，1640.

［5］ Oka K，Osaki T，Hanawa T，et al.Molecular and microbiological characterization of Clostridium difficile isolates from single，relapse，and reinfection cases［J］.J Clin Microbiol，2012，50（3）：915－921.

［6］ IlchmannC，Zaiss NH，Speicher A，et al.Comparison of resistance against erythromycin and moxifloxacin，presence of binary toxin gene and PCR ribotypesin Clostridium difficile isolates from1990 and 2008［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2010，29（12）：1571－1573.

［7］ 黃海輝，吳湜，朱德妹，等.臨床分離艱難梭菌188株的耐藥性研究［J］.中國(guó)感染與化療雜志，2011，11（1）：1－5.

［8］ SurawiczCM，Brandt LJ，Binion DG，et al.Guidelines for diagnosis，treatment，and prevention of Clostridium difficile infections［J］.Am J Gastroenterol，2013，108（4）：478－498.

［9］ PelaezT，AlcaláL，Alonso R，et al.In vitro activity of ramoplanin against Clostridium difficile，including strains with reduced susceptibility to vancomycin or with resistance to metronidazole［J］.Antimicrob Agents Chemother，2005，49（3）：1157－1159.

［10］ Stubbs SL，Brazier JS，O′Neill GL，et al.PCR targeted to the 16S－23S rRNA gene intergenic spacer region of Clostridium di f f icile and construction of a library consisting of 116 different PCR ribotypes［J］.J Clin Microbiol，1999，37（2）：461－463.

［11］ Stabler RA，Dawson LF，Valiente E，et al.Macro and micro diversity of Clostridium difficile isolates from diverse sources and geographical locations［J］.PLoS One，2012，7（3）：e31559.

［12］ Clinical and Laboratory Standards Institute.Methods for antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria［M］.8th ed.Approved standard M11－A8.Wayne，PA：CLSI，2012.

［13］ Aspevall O，Lundberg A，Burman LG，et al.Antimicrobial susceptibility pattern of Clostridium difficile and its relation to PCR ribotypes in a Swedish university hospital［J］.Antimicrob Agents Chemother，2006，50（5）：1890－1892.

［14］ Bourgault AM，Lamothe F，Loo VG，et al.In vitro susceptibility of Clostridium difficile clinical isolates from a multiinstitutional outbreak in Southern Quebec，Canada［J］.Antimicrob Agents Chemother，2006，50（10）：3473－3475.

［15］ Cheknis AK，Sambol SP，Davidson DM，et al.Distribution of Clostridium difficile strains from a North American，European and Australian trial of treatment for C.difficileinfections：2005－2007［J］.Anaerobe，2009，15（6）：230－233.

［16］ Iwashima Y，Nakamura A，Kato H，et al.A retrospective study of the epidemiology of Clostridium difficile infectionat a University Hospital in Japan：genotypic features of the isolates and clinical characteristics of the patients［J］.J Infect Chemother，2010，16（5）：329－333.

［17］ Kim H，Riley TV，Kim M，et al.Increasing prevalence of toxin A－negative，toxin B－positive isolates of Clostridium difficile in Korea：impact on laboratory diagnosis［J］.J Clin Microbiol，2008，46（3）：1116－1117.

［18］ 章黎華，董丹鳳，江岑，等.院內(nèi)感染艱難梭菌的毒素檢測(cè)及核糖體分型研究［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，32（11）：1436－1439.

［19］ Peláez T，Cercenado E，AlcaláL，et al.Metronidazole resistance in Clostridium diffiile is heterogeneous［J］.J Clin Microbiol，2008，46（9）：3028－3032.

［20］ Huang H，Weintraub A，F(xiàn)ang H，et al.Antimicrobial susceptibility and heteroresistance in Chinese Clostridium difficile strains［J］.Anaerobe，2010，16（6）：633－635.

［21］ Paphitou NI.Antimicrobial resistance：action to combat therisingmicrobial challenges［J］.Int J Antimicrob Agents，2013，42 Suppl：s25－s28.

［22］ Vonberg RP，Kuijper EJ，Wilcox MH，et al.Infection control measures to limit the spread of Clostridium difficile［J］.Clin Microbiol Infect，2008，14 Suppl 5：2－20.