胡路

(重慶市萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所,重慶 404100)

食品衛(wèi)生微生物檢測(cè)用培養(yǎng)基質(zhì)量控制探討

胡路

(重慶市萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所,重慶 404100)

培養(yǎng)基質(zhì)量是微生物檢測(cè)工作的基礎(chǔ),直接決定檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況,明確了培養(yǎng)基的購(gòu)置、貯存、制備、性能測(cè)試等過(guò)程的質(zhì)量控制措施,以確保培養(yǎng)基質(zhì)量滿足檢測(cè)要求。

培養(yǎng)基 質(zhì)量控制 微生物檢測(cè)

食品微生物檢測(cè)是不同食品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的食品必檢項(xiàng)目之一，是按照一定的檢測(cè)程序和質(zhì)量控制措施，確定單位樣品中某種或某類微生物的數(shù)量或存在狀況。而培養(yǎng)基質(zhì)量是微生物檢測(cè)工作的基礎(chǔ)，直接決定檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性。由于食品微生物培養(yǎng)基品種較多，目前大約有數(shù)千種不同的培養(yǎng)基，有液態(tài)、半固體、固體幾種形式。而培養(yǎng)基質(zhì)量控制國(guó)內(nèi)可以參考的資料不多，國(guó)外的起點(diǎn)較高，又不適宜我國(guó)國(guó)情，依據(jù)GB/T27405《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品微生物檢測(cè)》(1)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況，明確了培養(yǎng)基的購(gòu)置、貯存、制備、性能測(cè)試等過(guò)程的質(zhì)量控制措施，以確保培養(yǎng)基質(zhì)量滿足檢測(cè)要求。

1 培養(yǎng)基的采購(gòu)、驗(yàn)收和儲(chǔ)存

培養(yǎng)基的采購(gòu)應(yīng)從合格供應(yīng)商中選擇廠商采購(gòu)，每批培養(yǎng)基需供應(yīng)商提供批號(hào)和相對(duì)應(yīng)的質(zhì)檢報(bào)告。購(gòu)買的培養(yǎng)基到貨后，由藥品管理員和微生物檢測(cè)人員共同核對(duì)生產(chǎn)企業(yè)提供的資料、培養(yǎng)基名稱、規(guī)格數(shù)量、外觀特征、批號(hào)、保質(zhì)期是否符合要求。驗(yàn)收合格后，交由檢測(cè)人員接受保管，并在每瓶培養(yǎng)基上加貼信息標(biāo)簽。 根據(jù)不同的培養(yǎng)基的特性，妥善保存。干粉培養(yǎng)基應(yīng)保存在陰涼干燥處，要避免陽(yáng)光直射；開瓶后的干粉培養(yǎng)基易吸濕，應(yīng)注意防潮，并確保在有效期內(nèi)用完。需低溫保存的培養(yǎng)基應(yīng)存放在相應(yīng)溫度的低溫柜中。

2 培養(yǎng)基的配制

2.1 自制培養(yǎng)基

自制培養(yǎng)基，要嚴(yán)格按照所檢樣品檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)要求的配方進(jìn)行準(zhǔn)確稱量配制、稱量時(shí)各種不同組分，要用專用的角匙，避免交叉污染；干粉培養(yǎng)基易吸潮，如房間環(huán)境濕度較大時(shí)，應(yīng)提高稱量速度，完畢后及時(shí)蓋緊瓶蓋。制備培養(yǎng)基的水PH值在5.5—7.5之間，應(yīng)使用電阻率不小于30萬(wàn)Ωcm的蒸餾水，最好不使用離子交換器生產(chǎn)的去離子水。嚴(yán)格控制配制過(guò)程中滅菌的溫度、時(shí)間，配制完成后應(yīng)檢查PH值，觀察其顏色、透明度、雜質(zhì)、凝膠穩(wěn)定性等。

2.2 成品培養(yǎng)基

隨著市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，成品微生物培養(yǎng)基使用越來(lái)越多，成品培養(yǎng)基的特點(diǎn)就是方便、快捷、但成品較高。需要注意的是不同廠家，或同一廠家不同批號(hào)的相同培養(yǎng)基不能混用。

2.3 培養(yǎng)基溶解注意事項(xiàng)

(1)加熱溶解時(shí)不能用使用銅或鐵鍋，防止金屬離子混入培養(yǎng)基中，影響微生物的生長(zhǎng)[1]；

(2)溶解培養(yǎng)基容器的大小需大于溶解后培養(yǎng)基總體積的2倍以上，避免在加熱溶解過(guò)程中，培養(yǎng)基受熱，體積膨脹溢出；

(3)含有瓊脂類的培養(yǎng)基，在加熱溶解前可浸泡數(shù)分鐘，加熱時(shí)一定要進(jìn)行攪拌，以防瓊脂粘在容器底部；對(duì)于瓊脂類培養(yǎng)基進(jìn)行再融化時(shí)應(yīng)使用沸水浴或流動(dòng)蒸汽進(jìn)行加熱，反復(fù)凍容最多只能兩次，第二次再融化后仍未用完的培養(yǎng)基應(yīng)棄去；

(4)為避免燒焦和沸騰溢出，量少的培養(yǎng)基最好使用水浴進(jìn)行加熱；

(5)燒糊的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被破壞，并可產(chǎn)生有毒物質(zhì)，如發(fā)現(xiàn)焦化，或未溶解均勻前培養(yǎng)基有溢出，該培養(yǎng)基即不能使用，應(yīng)重新制備。

2.4 培養(yǎng)基的滅菌

(1)常用培養(yǎng)基一般采用高壓蒸汽濕熱滅菌，通常是121℃15min，含糖或特殊培養(yǎng)基，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或生產(chǎn)商提供的說(shuō)明滅菌。有些菌種代謝周期較短，已配制好的培養(yǎng)基必須在15分鐘內(nèi)滅菌，可避免微生物生長(zhǎng)繁殖而消耗養(yǎng)分，改變培養(yǎng)基的酸堿度。為避免高溫破壞培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分，降低瓊脂的凝膠強(qiáng)度，必須嚴(yán)格控制滅菌溫度和時(shí)間，不可重復(fù)滅菌。

(2)部分培養(yǎng)基(如嗜鹽瓊脂培養(yǎng)基、膽硫乳培養(yǎng)基等)只能煮沸滅菌。

(3)對(duì)熱敏感的培養(yǎng)基或添加物質(zhì)，應(yīng)采用膜過(guò)濾方法進(jìn)行過(guò)濾滅菌。

(4)即用型不需滅菌，應(yīng)參見相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)或培養(yǎng)基使用說(shuō)明書，直接使用。

(5)常規(guī)應(yīng)用指示劑監(jiān)測(cè)滅菌過(guò)程；可用生物指示劑如嗜熱脂肪芽孢桿菌監(jiān)測(cè)殺傷芽孢的效果。

(6)滅菌以后培養(yǎng)基應(yīng)該迅速冷卻至所需溫度，不能長(zhǎng)時(shí)間保存在滅菌鍋內(nèi)，造成過(guò)度滅菌，影響培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分或選擇性效果。并應(yīng)加貼標(biāo)識(shí)，標(biāo)注：名稱、配置日期、成分、pH值等信息。

3 培養(yǎng)基質(zhì)量控制方法

3.1 理化試驗(yàn)方法

3.1.1 培養(yǎng)基物理性檢測(cè)[2]

外包裝密封性應(yīng)完好，無(wú)泄漏等現(xiàn)象；顏色一般為淺色，狀態(tài)應(yīng)為干燥粉末，無(wú)吸潮結(jié)塊現(xiàn)象；成品培養(yǎng)基應(yīng)防止過(guò)分失水，還應(yīng)注意成品培養(yǎng)基如平皿裂紋、充碟不均、溶血(血平板)、冷凍、過(guò)多的汽包和斑點(diǎn)、污染，表面凹凸不平等現(xiàn)象，如有上訴缺陷，應(yīng)做好相應(yīng)記錄，并及時(shí)通知供應(yīng)商，查明原因并加以糾正。

3.1.2 PH值的測(cè)定

滅菌前后都應(yīng)測(cè)定其PH值，看是否滿足標(biāo)準(zhǔn)要求和滅菌前后PH值的變化差異是否正常，成品培養(yǎng)基是否符合標(biāo)簽要求。注意測(cè)量時(shí)盡量使培養(yǎng)基溫度控制在20℃-25℃。

3.1.3 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

凝膠強(qiáng)度表明培養(yǎng)基中瓊脂凝固的程度。可用凝膠強(qiáng)度測(cè)定儀測(cè)試。滅菌條件，特別是PH值會(huì)影響凝膠強(qiáng)度。凝膠強(qiáng)度統(tǒng)一使用g/cm2作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)表示培養(yǎng)基的硬度。成品干燥培養(yǎng)基的凝膠強(qiáng)度450-650g/cm2之間，半固體培養(yǎng)基的適宜凝膠強(qiáng)度在90g/cm2左右。

3.2 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法[3]

3.2.1 無(wú)菌試驗(yàn)

試驗(yàn)用培養(yǎng)基在按標(biāo)準(zhǔn)或使用說(shuō)明配制成新鮮的產(chǎn)品培養(yǎng)基，應(yīng)與標(biāo)本一致的環(huán)境條件進(jìn)行培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基應(yīng)無(wú)菌落生長(zhǎng)。

3.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

培養(yǎng)基在保質(zhì)期或有效期內(nèi)，各項(xiàng)指標(biāo)都應(yīng)在保質(zhì)期內(nèi)得到保證。不同培養(yǎng)基，保質(zhì)期不同，具體時(shí)間根據(jù)實(shí)際情況決定。

3.2.3 細(xì)菌學(xué)質(zhì)控試驗(yàn)

一般是測(cè)試培養(yǎng)基的靈敏度和準(zhǔn)確度。是培養(yǎng)基的重要內(nèi)在質(zhì)量指標(biāo)，它是用已知的標(biāo)準(zhǔn)菌株按照規(guī)程和檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的要求測(cè)定培養(yǎng)基的性能是否符合，測(cè)試菌株是具有其代表種的穩(wěn)定特性并能有效證明實(shí)驗(yàn)室特定培養(yǎng)基最佳性能的一套菌株，應(yīng)來(lái)自國(guó)際/國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株。所有培養(yǎng)基在使用前均應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌學(xué)質(zhì)控試驗(yàn)。

3.2.4 固體培養(yǎng)基試驗(yàn)方法

(1)平板涂布法：將試驗(yàn)和對(duì)照培養(yǎng)基做成4mm厚的平板并使表面干燥，將試驗(yàn)和對(duì)照培養(yǎng)基進(jìn)行系列稀釋度接種，每個(gè)稀釋度各取4滴，分別加入4個(gè)試驗(yàn)和對(duì)照培養(yǎng)基；從高稀釋度開始涂布，培養(yǎng)平板，并對(duì)數(shù)量和菌落形態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

評(píng)價(jià)方法：PR(生長(zhǎng)率)=Ns(試驗(yàn)培養(yǎng)基的菌落數(shù))/N0(對(duì)照培養(yǎng)基的菌落數(shù))

根據(jù)培養(yǎng)基的不同，是否為選擇性培養(yǎng)基等具體情況，查表得出滿意率。

(2)劃線法：將平板按同一方向劃線，開始為涂抹區(qū)，然后用火焰對(duì)接種針滅菌，經(jīng)滅菌冷卻后的接種針，劃過(guò)涂抹區(qū)引三道線出來(lái)至干凈的平板，然后繼續(xù)劃線，菌液濃度逐步降低，最終能分離出單個(gè)菌落。

評(píng)價(jià)方法：此法屬于半定量，在實(shí)際操作中多用于定性質(zhì)控，檢查是否有典型菌落生長(zhǎng)。

3.2.5 液體培養(yǎng)基試驗(yàn)方法

一般為目標(biāo)和非目標(biāo)微生物的定量稀釋法，液體培養(yǎng)基一般為10ml/管待檢。不同培養(yǎng)基，根據(jù)不同標(biāo)準(zhǔn)接種少量的目標(biāo)微生物、和大量的非目標(biāo)微生物到試驗(yàn)肉湯和對(duì)照肉湯中培養(yǎng)，每種肉湯接種培養(yǎng)后涂布到非抑制性培養(yǎng)基上。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著我國(guó)食品安全檢測(cè)的不斷加強(qiáng)，食品衛(wèi)生微生物檢測(cè)越來(lái)越重要，我國(guó)微生物培養(yǎng)基的生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)、和使用管理制度將日趨嚴(yán)格，做好食品衛(wèi)生微生物培養(yǎng)基質(zhì)控驗(yàn)證工作將是我們面臨的重點(diǎn)。

[1]李志芬,劉銳萍,杜偉,劉珊珊.微生物檢測(cè)用培養(yǎng)基、試劑質(zhì)量控制方法研究[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2013年5月第25卷第5期.

[2]吳清平,孟凡亞,蔡芷荷,劉秀梅,楊寧.微生物培養(yǎng)基質(zhì)量控制技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)[J].微生物學(xué)通報(bào),2006,33(6)：128-132

[3]張喜.商品微生物培養(yǎng)基質(zhì)量狀況及其控制[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2009年6月第15卷第16期總第171期.