， ，顯凱

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所創(chuàng)傷科，重慶 400042；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院急診科，重慶 402160)

膿毒癥(sepsis)指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，可發(fā)展成為多器官功能不全(multiple organ dysfun-ction syndrome，MODS)。在ICU感染患者中，有嚴(yán)重膿毒癥或膿毒癥休克占30.8%，并且病死率可達(dá)38.96%[1]。腸道不僅是膿毒癥時(shí)臟器損害的重要靶器官，腸道功能障礙更是膿毒癥的“始動(dòng)因素”，也是由膿毒癥發(fā)展至MODS的重要因素之一[2]。因此，在膿毒癥救治過(guò)程中，如何保護(hù)腸道功能對(duì)改善膿毒癥預(yù)后具有重要意義。烏司他丁(UTI)是一種蛋白酶抑制劑，能同時(shí)抑制多種水解酶活性。已發(fā)現(xiàn)UTI可以抑制炎癥介質(zhì)的過(guò)度釋放[3]，改善微循環(huán)和組織灌注，臨床已開(kāi)始用于膿毒癥的治療。Ghrelin(GHL)是生長(zhǎng)激素促分泌素受體(growth hormone secretagogue receptor，GHSR)的內(nèi)源性配體，具有抗炎作用，能改善膿毒癥時(shí)腸運(yùn)動(dòng)功能[4]，顯示了其針對(duì)膿毒癥的潛在應(yīng)用價(jià)值。雖然已有的文獻(xiàn)認(rèn)為，UTI、GHL均可改善膿毒癥時(shí)臟器功能障礙，減輕炎癥反應(yīng)，但特異針對(duì)膿毒癥時(shí)腸功能障礙的相關(guān)研究較少，且相應(yīng)機(jī)制也不甚明了。鑒于腸道在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中的重要作用，本實(shí)驗(yàn)以內(nèi)毒素血癥為膿毒癥模型，觀察了UTI、ghrelin對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠小腸屏障功能、運(yùn)動(dòng)功能及全身和腸道局部炎癥反應(yīng)的影響，以期為膿毒癥時(shí)腸功能障礙的治療提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量為220～240 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前禁食8 h，禁水4 h。

1.2 主要試劑及儀器

內(nèi)毒素粉劑(LPS)、ghrelin、小腸葡聚糖藍(lán)-2000(BD-2000)；注射用烏司他丁(規(guī)格：每支10萬(wàn)U，國(guó)藥準(zhǔn)字H19990134)；大鼠腫瘤細(xì)胞壞死因子(TNF-α)、大鼠白介素6(IL-6)、大鼠高遷移率族蛋白1(HMGB1)ELISA試劑盒；RNA提取試劑Trizol Reagent；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；PCR試劑盒；BCA試劑盒；腸黏膜防御素-5(RD-5)、腸三葉因子家族-3(TFF-3)、β-actin引物由上海百力格生物技術(shù)有限公司合成；光學(xué)顯微鏡、PCR儀、分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及膿毒癥模型的建立

將60只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為5組(n=12)，分別為對(duì)照組(CON組)、內(nèi)毒素組(LPS組)、烏司他丁組(UTI組)、ghrelin組(GHL組)、UTI+ghrelin組(UTI+GHL組)。大鼠以3%的戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉。各實(shí)驗(yàn)組麻醉后，以LPS 15 mg/kg腹腔注射構(gòu)建內(nèi)毒素血癥模型，CON組以等量生理鹽水代替內(nèi)毒素腹腔注射。在LPS注射后10 min，UTI組以UTI 15×104U/kg腹腔注射[5]，GHL組給予ghrelin 25 μg/kg腹腔注射[6]，UTI+GHL組給予UTI 15×104U/kg+ghrelin 25 μg/kg腹腔注射，CON、LPS組給予同等劑量生理鹽水。各組12 h后再次給藥。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組于術(shù)后12 h和24 h分別處死6只大鼠并留取標(biāo)本。

1.4 小腸黏膜屏障功能的測(cè)定

1.4.1 觀察黏膜組織病理變化 剪取回腸2 cm，置于4%的甲醛水溶液中固定48 h，石蠟包埋，連續(xù)切片(厚度小于5 μm)，HE染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RD-5和TFF3的mRNA表達(dá)水平 Trizol法提取回腸樣本中總RNA，鑒定后以1 μl RNA為模板，用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ操作說(shuō)明進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系20 μl，擴(kuò)增條件：94 °C 30 s，94 °C 30 s，55 °C變性1 min，70 °C退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。引物：RD-5，上游為GAAGACACTTGTCCTCCTTTCTG，下游為T(mén)GTTGCAGATCCCCATAATGCCT；TFF-3，上游為GATAACCCTGCTGCTGGTCCTG，下游為GGGCACATTTGGGATGCTGGAG；β-actin，上游為AGACAGCCGCATCTTCTTGT，下游為CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT。以β-actin為參照，采用Quantity One圖像分析軟件計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 小腸運(yùn)動(dòng)功能測(cè)定

隨機(jī)選取各實(shí)驗(yàn)組6只大鼠，于造模后4 h用濃度為1%BD-2000(5 mL/kg)給實(shí)驗(yàn)組大鼠灌胃，并在造模后12 h處死動(dòng)物，取全腸以5 g天平砝碼垂掛測(cè)量其長(zhǎng)度，再測(cè)量BD-2000染色長(zhǎng)度，計(jì)算動(dòng)物小腸傳輸百分率(小腸傳輸百分率=小腸染色長(zhǎng)度/小腸總長(zhǎng)度×100%)。

1.6 血清炎癥因子表達(dá)水平測(cè)定

處死各組大鼠時(shí)經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，靜置30 min后，3 000 r/min離心5 min取血清，-80 ℃保存。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作，檢測(cè)血清TNF-α、IL-6、HMGB1水平。

1.7 腸黏膜炎癥因子表達(dá)水平測(cè)定

處死各組大鼠時(shí)取腸黏膜，與組織裂解液混合充分研磨，靜置30 min后，12 000 r/min離心10 min取上清，用BCA法測(cè)蛋白濃度后，用組織裂解液配成50 μg/μl，-80 ℃保存。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作，檢測(cè)血清TNF-α、IL-6、HMGB1。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小腸黏膜屏障功能變化

2.1.1 光鏡下大鼠小腸組織病理學(xué)改變 12 h時(shí)觀察：CON組小腸各層結(jié)構(gòu)清晰，黏膜表層完整，腺體排列整齊；LPS組小腸絨毛頂端上皮下毛細(xì)血管充血及脫落，中央乳糜管擴(kuò)張，固有層裸露、崩解，毛細(xì)血管出血；UTI組小腸出現(xiàn)小部分絨毛頂端上皮脫落，中央乳糜管小幅度擴(kuò)張；GHL組小腸絨毛頂端上皮下毛細(xì)血管充血及脫落，中央乳糜管擴(kuò)張；UTI+GHL組小腸出現(xiàn)少量絨毛頂端上皮脫落，中央乳糜管小幅度擴(kuò)張(圖1)。24 h時(shí)鏡下觀察小腸組織病理學(xué)改變與12 h時(shí)結(jié)果類(lèi)似。

2.1.2 腸黏膜RD-5及TFF3的mRNA表達(dá)水平變化 12 h時(shí)LPS組RD-5及TFF3的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著下降(P<0.01)，而UTI組和UTI+GHL組RD-5及TFF3的mRNA表達(dá)水平較LPS組明顯升高(P<0.01)，且UTI+GHL組提高效果優(yōu)于UTI組(P<0.05)，而GHL組對(duì)RD-5及TFF3的mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯影響(P>0.05)。24 h檢測(cè)各組數(shù)據(jù)與12 h時(shí)結(jié)果相似(圖2)。

a：CON組；b：LPS組；c：UTI組；d：GHL組；e：UTI+GHL組

*：與LPS組比較，P<0.05；△：與LPS組比較，P<0.01；#：與UTI+GHL組比較，P<0.05；▲：與UTI+GHL組比較，P<0.01

圖2各實(shí)驗(yàn)組大鼠回腸黏膜不同時(shí)間點(diǎn)RD-5及TFF3的mRNA的表達(dá)

2.2 小腸BD-2000推進(jìn)率

12 h時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)各組小腸BD-2000推進(jìn)率，LPS組較對(duì)照組小腸運(yùn)動(dòng)功能減弱明顯，而GHL組以及UTI+GHL組能夠改善膿毒癥大鼠小腸運(yùn)動(dòng)功能(P<0.05)，并且UTI+GHL組效果較GHL組更為顯著(P<0.05)，但UTI組無(wú)明顯改善作用(圖3)。

2.3 血清炎癥介質(zhì)水平變化

12 h、24 h時(shí)間點(diǎn)LPS組血清TNF-α、IL-6、HMGB1水平顯著高于對(duì)照組及其余各組(P<0.01)，UTI+GHL組、UTI組以及GHL組較LPS組各時(shí)間點(diǎn)TNF-α、IL-6、HMGB1水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

2.4 回腸黏膜炎癥介質(zhì)水平變化

12 h、24 h時(shí)間點(diǎn)LPS組回腸黏膜組織中TNF-α、IL-6、HMGB1水平顯著高于對(duì)照組及其余各組(P<0.05)，UTI+GHL組、UTI組及GHL組TNF-α、IL-6、HMGB1水平顯著低于LPS組(P<0.05)，與血清中檢測(cè)結(jié)果基本一致(圖5)。

*：與LPS組比較，P<0.01；#：與UTI+GHL組比較，P<0.05；△：與UTI+GHL組比較，P<0.01

圖3各實(shí)驗(yàn)組大鼠小腸BD-2000推進(jìn)率

*：與LPS組比較，P<0.05；△：與LPS組比較，P<0.01；#：與UTI+GHL組比較，P<0.05；▲：與UTI+GHL組比較，P<0.01

圖4各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α、IL-6、HMGB1水平

*：與LPS組比較，P<0.05；△：與LPS組比較，P<0.01；#：與UTI+GHL組比較，P<0.05；▲：與UTI+GHL組比較，P<0.01

圖5各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腸黏膜TNF-α、IL-6、HMGB1水平

3 討論

膿毒癥是多因素共同作用導(dǎo)致的獲得性疾病，可由先天應(yīng)激、細(xì)胞損傷以及器官功能障礙等因素引起[7]，最常累及腸道，造成腸黏膜上皮水腫，上皮細(xì)胞膜及細(xì)胞間連接斷裂，細(xì)胞壞死，上皮從絨毛頂端脫落，甚至黏膜全層脫落而形成潰瘍。腸道損傷后，其通透性增加、腸屏障功能受損，腸道細(xì)菌及其毒素得以吸收進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)而發(fā)生細(xì)菌移位，使SIRS加劇、失控，嚴(yán)重時(shí)誘發(fā)MODS，增加救治難度[8]。因而，在膿毒癥的防治過(guò)程，如何改善腸道功能，是提高其救治成功率的關(guān)鍵之一。

腸道運(yùn)動(dòng)功能、消化吸收功能以及屏障功能是維持機(jī)體正常功能所必需。腸道屏障由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障與生物屏障共同構(gòu)成，其中機(jī)械屏障和免疫屏障的功能是判斷腸道屏障功能的常見(jiàn)指標(biāo)。完整的彼此緊密連接的腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)構(gòu)成了腸道的機(jī)械屏障；RD-5和TFF-3則是評(píng)價(jià)腸道免疫屏障功能的標(biāo)志物。體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)RD-5在保護(hù)腸道屏障功能中發(fā)揮著極為重要的作用[9]，TFF-3可與黏液糖蛋白相互作用，具有修復(fù)腸黏膜細(xì)胞和保護(hù)腸黏膜細(xì)胞的功能[10]。

在本實(shí)驗(yàn)以內(nèi)毒素誘導(dǎo)的膿毒癥模型中，腸黏膜的機(jī)械屏障和免疫屏障均受到不同程度的損害，表現(xiàn)為光鏡下腸黏膜組織超微結(jié)構(gòu)的改變，例如：小腸絨毛頂端上皮下毛細(xì)血管充血及脫落，中央乳糜管擴(kuò)張，固有層裸露、崩解，毛細(xì)血管出血等。同時(shí)伴有RD-5和TFF-3 mRNA的表達(dá)下調(diào)等。UTI和GHL均能不同程度減輕腸黏膜組織超微結(jié)構(gòu)的損害，同時(shí)，UTI還能上調(diào)腸黏膜RD-5和TFF-3 mRNA的表達(dá)，而GHL在本實(shí)驗(yàn)條件下，未觀察到這種作用，但能加強(qiáng)UTI的效應(yīng)。說(shuō)明UTI能有效改善膿毒癥時(shí)的腸屏障功能，聯(lián)合應(yīng)用GHL能進(jìn)一步減輕腸屏障損傷。本實(shí)驗(yàn)觀察到內(nèi)毒素血癥時(shí)動(dòng)物出現(xiàn)腸運(yùn)動(dòng)功能障礙，表現(xiàn)為小腸BD-2000推進(jìn)率明顯下降。這種腸動(dòng)力的缺失，可導(dǎo)致中毒性腸麻痹、腸腔積液積氣、麻痹性腸梗阻等，嚴(yán)重者可出現(xiàn)腸缺血壞死、穿孔，甚至引起腹腔間隙綜合征(abdominal compartment syndrome，ACS)。應(yīng)用GHL能顯著加強(qiáng)內(nèi)毒素血癥大鼠的腸運(yùn)動(dòng)功能，其機(jī)制可能與降低Bcl-2和Bax的表達(dá)，抑制組織細(xì)胞凋亡的發(fā)生有關(guān)[11]。UTI雖然對(duì)膿毒癥時(shí)的腸運(yùn)動(dòng)功能影響不明顯，但能增強(qiáng)GHL的作用。

TNF-α、IL-6和HMGB1是膿毒癥發(fā)生、發(fā)展中十分重要的炎癥介質(zhì)，可誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)，進(jìn)而造成包括腸道在內(nèi)的諸多臟器損害[12-14]。已有文獻(xiàn)報(bào)告，UTI和GHL均可抑制全身炎癥反應(yīng)[15-16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，UTI、ghrelin不僅能降低膿毒癥時(shí)血清TNF-α、IL-6和HMGB1水平，即減輕全身炎癥反應(yīng)，還能顯著抑制腸道黏膜組織中的TNF-α、IL-6和HMGB1水平，即還能抑制腸道黏膜組織的局部炎癥反應(yīng)，且二者在全身及臟器組織局部水平上均有協(xié)同作用。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察到的UTI對(duì)腸屏障功能的保護(hù)以及GHL促進(jìn)腸道運(yùn)動(dòng)的機(jī)制不僅與二者抑制全身炎癥反應(yīng)的效應(yīng)有關(guān)，同時(shí)還與其降低腸黏膜局部組織的炎癥反應(yīng)有著密切聯(lián)系。

腸道屏障功能和運(yùn)動(dòng)功能是相互依賴、緊密聯(lián)系的。腸運(yùn)動(dòng)功能的正常依賴于腸屏障結(jié)構(gòu)的完整；反之，腸屏障結(jié)構(gòu)和功能的損害，必然導(dǎo)致腸運(yùn)動(dòng)功能的減弱。因而，雖然本實(shí)驗(yàn)未觀察到膿毒癥時(shí)GHL對(duì)腸黏膜有直接的保護(hù)作用，但卻通過(guò)改善腸運(yùn)動(dòng)功能，增強(qiáng)了UTI對(duì)腸黏膜的保護(hù)效應(yīng)。同樣，由于對(duì)腸黏膜的保護(hù)作用，UTI能增強(qiáng)GHL促進(jìn)腸運(yùn)動(dòng)的效應(yīng)。

綜上所述，UTI聯(lián)合ghrelin能顯著改善膿毒癥大鼠的腸道功能，其機(jī)制可能與其抑制膿毒癥大鼠全身炎癥反應(yīng)及腸黏膜局部炎癥反應(yīng)有關(guān)，顯示了二者聯(lián)合用于膿毒癥時(shí)的潛在價(jià)值。至于UTI和GHL在抑制全身及腸黏膜局部組織炎癥反應(yīng)方面的協(xié)同作用機(jī)制，尚需進(jìn)一步探索。

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