鄭貴浪 廖保南 林千文

PM2.5通過(guò)線(xiàn)粒體介導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷作用機(jī)制的初步研究

鄭貴浪 廖保南 林千文

目的 初步探討PM2.5對(duì)大鼠心肌細(xì)胞的損害及線(xiàn)粒體介導(dǎo)的相關(guān)作用機(jī)制。方法 培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞株H9C2細(xì)胞，給予PM2.5刺激，24 h后檢查肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH），比色法檢測(cè)線(xiàn)粒體的活性氧（ROS）和ATP酶的活性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)線(xiàn)粒體腫脹度及膜電位。結(jié)果 PM2.5組心肌細(xì)胞CK 和 LDH 明顯升高［（702±80）U/ml比（987±92）U/ml，（339±72）U/L 比（485±84）U/L）］，ATP 酶活性下降明顯［（34.2±5.2）U/mgprot比（54.1±6.9）U/mgprot］，細(xì)胞內(nèi) ROS 明顯增多［（67.2±8.2）U/well比（25.4±7.3）U/well］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時(shí)PM2.5組心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體明顯腫脹，線(xiàn)粒體膜電位明顯下降（0.3476±0.1232比0.6476±0.1021），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 PM2.5可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與PM2.5損害線(xiàn)粒體的結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)。

PM2.5；心肌細(xì)胞；線(xiàn)粒體；膜電位；活性氧

顆粒物是城市主要的大氣污染物，其粒徑大小、形態(tài)及組成成分都與人體健康密切相關(guān)。其中空氣動(dòng)力學(xué)直徑＜2.5μm的細(xì)顆粒物（PM2.5）與人體健康關(guān)系最為密切。PM2.5主要來(lái)自于人類(lèi)活動(dòng)如工業(yè)生產(chǎn)及交通運(yùn)輸工具尾氣排放、吸煙的煙霧釋放等。其化學(xué)成分復(fù)雜，包括無(wú)機(jī)成分、有機(jī)成分、微量重金屬元素和元素碳等[1,2]。

流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，PM2.5與人類(lèi)心血管疾病有密切關(guān)系，不但可增加高血壓、冠心病、糖尿病患者的心血管疾病發(fā)病率和死亡率，亦可增高健康人群心血管疾病發(fā)病率和死亡率[3-5]?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）是指具有氧化還原潛能的氧衍生物，包括游離的基團(tuán)如超氧陰離子、羥自由基、次氯酸鹽、過(guò)氧亞硝酸鹽和穩(wěn)定的基團(tuán)如過(guò)氧化氫。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，其與體內(nèi)氧化應(yīng)激長(zhǎng)期慢性的過(guò)度激活有關(guān)[6]。有不少研究[7-9]顯示，PM2.5的毒性作用與ROS過(guò)多產(chǎn)生有關(guān)。

線(xiàn)粒體是細(xì)胞的“動(dòng)力工廠”，同時(shí)也是ROS產(chǎn)生的重要部位。然而，PM2.5是否損害心臟，是否可以通過(guò)損害線(xiàn)粒體，使ROS產(chǎn)生過(guò)多，進(jìn)而損害心肌細(xì)胞？目前研究甚少。本研究擬采用大鼠心肌細(xì)胞株H9C2，通過(guò)體外給予PM2.5刺激，檢測(cè)細(xì)胞損傷及線(xiàn)粒體ROS等變化，初步揭示PM2.5對(duì)心肌細(xì)胞的損傷機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 PM2.5的采樣及配制 采樣：選取湛江市區(qū)汽車(chē)流量大、污染較重的地區(qū)為采樣點(diǎn)。用PM2.5采樣儀采集PM2.5于專(zhuān)用濾紙上，采樣后將載有顆粒物的濾紙剪成1 cm2小塊，浸于三蒸水中，超聲震蕩30 min×4次，洗脫顆粒物，震蕩液經(jīng)6層紗布過(guò)濾，濾液4℃，10 000 rpm/min離心20 min后收集下層懸液于玻璃平皿中，冷凍真空干燥成干粉，－20℃保存?zhèn)溆谩Ｅ渲疲悍Q(chēng)取一定量PM2.5干粉，經(jīng)紫外線(xiàn)照射30 min后，在超凈臺(tái)中加入培養(yǎng)基溶液混勻，配制成終濃度為 10、50、100 μg/ml的溶液進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用50 μg/ml作為本實(shí)驗(yàn)的刺激劑量。

1.2 H9C2細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理 H9C2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保存委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，用10%小牛血清培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；1～3 d更換一次培養(yǎng)液。PBS輕柔沖洗，適量0.25%胰酶溶液消化等常規(guī)操作，進(jìn)行傳代及實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右密度時(shí)，進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。H9C2細(xì)胞分成兩組，每組3個(gè)樣本。PM2.5組和正常對(duì)照組（NC組）分別給予50 μg/ml的PM2.5培養(yǎng)基和無(wú)PM2.5培養(yǎng)基刺激。刺激后6 h更換培養(yǎng)液，24 h檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.3 肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)H9C2大鼠心肌細(xì)胞PM2.5刺激后24 h，收集細(xì)胞上清液，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（比色法），貨號(hào) A020-1；肌酸激酶（CK）測(cè)定試劑盒（比色法），貨號(hào)A032。兩試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.4 線(xiàn)粒體的提取 按照線(xiàn)粒體提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作（購(gòu)自南京建成生物工程研究所，貨號(hào)：G003）。簡(jiǎn)要步驟：常規(guī)收集細(xì)胞，用PBS洗滌一次，離心收集細(xì)胞，吸盡上清。每次提取需要5×107個(gè)細(xì)胞。加入裂解液重懸細(xì)胞，放置10 min，研磨細(xì)胞30～40次。轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管中，離心，取上清。取上清液0.5 ml與0.5 ml溶液A混合，離心后的上清為胞漿成分，沉淀則為線(xiàn)粒體。棄上清，往沉淀中加入漂洗液重懸線(xiàn)粒體沉淀，離心棄上清。用50～100 μl儲(chǔ)存液重懸線(xiàn)粒體沉淀，立即使用。電鏡鑒定確定提取的是線(xiàn)粒體。

1.5 線(xiàn)粒體腫脹程度的檢測(cè) 取1 ml線(xiàn)粒體混懸液進(jìn)行心肌線(xiàn)粒體腫脹程度的流式細(xì)胞儀分析，用前向角與側(cè)向角平均熒光強(qiáng)度的比值（FSC/SSC）表示線(xiàn)粒體的腫脹程度[10,11]。

1.6 線(xiàn)粒體膜電位的檢測(cè) 按照凱基細(xì)胞凋亡線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）說(shuō)明書(shū)操作（購(gòu)自凱基生物，貨號(hào)：KGA604）。簡(jiǎn)要步驟：收集不多于 1×106的細(xì)胞；Incubation Buffer預(yù)熱至 37℃，加入JC-1。JC-1工作液將細(xì)胞均勻懸浮，孵育15～20 min；Incubation Buffer洗2次；流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果采用PI通道和PITC通道的平均熒光強(qiáng)度的比值（PI/PITC）表示線(xiàn)粒體膜電位[10]。

1.7 線(xiàn)粒體ROS檢測(cè) 按照活性氧檢測(cè)試劑盒進(jìn)行操作，試劑盒購(gòu)自碧云天，貨號(hào)S0033。簡(jiǎn)要步驟為：各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)處理后，按照試劑說(shuō)明用1∶1000無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μm。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFHDA。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常六孔板的一個(gè)孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1 ml。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)[12]，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm 和 535 nm，測(cè)定 5～10 min。

1.8 線(xiàn)粒體ATP酶活力的測(cè)定 按照ATP酶試劑盒（比色法）操作。試劑盒貨號(hào)：A016-1，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。ATP酶可分解ATP生成ADP及無(wú)機(jī)磷，測(cè)定無(wú)機(jī)磷的量可判斷ATP酶活力的高低。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有計(jì)量資料均以±s表示，方差齊時(shí)成組t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用近似t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組心肌細(xì)胞CK和LDH比較 PM2.5組心肌細(xì)胞 CK 為（702±80）U/ml，LDH 為（987±92）U/L，均明顯高于 NC 組的（339±72）U/ml和（485±84）U/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t1=5.8，P<0.05；t2=6.9，P<0.05）。PM2.5導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷。見(jiàn)表1。

表1 兩組CK、LDH、線(xiàn)粒體腫脹度和線(xiàn)粒體膜電位的比較（±s）

表1 兩組CK、LDH、線(xiàn)粒體腫脹度和線(xiàn)粒體膜電位的比較（±s）

注：與NC組相比，aP<0.05

線(xiàn)粒體膜電位（PI/PITC）NC 組 339±72 485±84 0.4693±0.0653 0.6476±0.1021 PM2.5 組 702±80a 987±92a 0.6457±0.0734a 0.3476±0.1232a組別 CK（U/ml）LDH（U/L）線(xiàn)粒體腫脹度（FSC/SSC）

2.2 兩組心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體腫脹程度及膜電位比較流式細(xì)胞儀檢測(cè)示，PM2.5組腫脹程度明顯高于NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.1，P<0.05）；PM2.5組的線(xiàn)粒體膜電位低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.2，P<0.05）。電鏡檢查可見(jiàn)，PM2.5組心肌細(xì)胞與NC組相比，線(xiàn)粒體腫脹，線(xiàn)粒體嵴模糊，基質(zhì)凝固、部分空泡化。提示PM2.5損害了線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)。見(jiàn)表1、圖 1～3。

2.3 兩組心肌細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)ROS及線(xiàn)粒體ATP酶活性比較 PM2.5組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯高于 NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.6，P<0.05）；而其ATP酶活性卻明顯低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.0，P<0.05）。提示PM2.5損害了線(xiàn)粒體的功能。見(jiàn)表2。

3 討論

圖1 心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體腫脹程度流式分析圖

圖2 心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位

圖3 心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體電鏡觀察（×30 000）

近年來(lái)，環(huán)境污染越來(lái)越受到關(guān)注。大氣污染的重要物質(zhì)PM2.5，可作為載體吸附有毒重金屬、酸性氧化物、有機(jī)污染物、細(xì)菌和病毒等多種組分，成為毒物富集中心和化學(xué)反應(yīng)床，嚴(yán)重危害人體健康。PM2.5對(duì)人體呼吸系統(tǒng)的影響，得到了深入廣泛的研究；對(duì)心血管系統(tǒng)的影響，也備受關(guān)注。有學(xué)者[13,14]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，PM2.5可抑制心臟搏動(dòng)，引起心率變異性降低，心肌細(xì)胞變性和間質(zhì)細(xì)胞增生，導(dǎo)致以心肌間質(zhì)纖維化為主要表現(xiàn)的心肌重構(gòu)；使血管收縮，血壓上升；通過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷血管黏膜，引起血管通透性及血液黏度增加，加速主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化和斑塊破裂過(guò)程[15]；誘發(fā)心律失常、心肌缺血甚至心臟停搏[16,17]。

表2 兩組心肌細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)ROS及線(xiàn)粒體ATP酶活性比較（±s）

表2 兩組心肌細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)ROS及線(xiàn)粒體ATP酶活性比較（±s）

注：與NC組相比，aP<0.05

線(xiàn)粒體ATP酶活性（U/mgprot）NC 組 3 25.4±7.3 54.1±6.9 PM2.5 組 3 67.2±8.2a 34.2±5.2a組別 樣本 細(xì)胞內(nèi)ROS（U/Well）

本研究通過(guò)大鼠心肌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)PM2.5可以引起心肌細(xì)胞肌酸激酶和乳酸脫氫酶增高，提示其對(duì)心肌細(xì)胞的毒性作用。血管疾病的致病過(guò)程是一個(gè)長(zhǎng)期積累的過(guò)程，目前已知的致病因素包括吸煙、酗酒、肥胖及高鈉、高脂飲食等。PM2.5可誘發(fā)、加重人體的心血管病變，這一結(jié)論已得到越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持。段軍等[18]在大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，PM2.5能增加大鼠左右心室心肌細(xì)胞合成和分泌NGF蛋白，從而導(dǎo)致心室交感神經(jīng)分布密度增加，證實(shí)具有致交感神經(jīng)重構(gòu)作用。董晨等[16]發(fā)現(xiàn)PM2.5對(duì)SH大鼠心臟有一定的急性毒性作用，并可引起心臟重構(gòu)。鄭燦軍等[19]發(fā)現(xiàn)，PM2.5及其組分還可抑制心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率，并存在劑量-反應(yīng)關(guān)系。此外，國(guó)外也有不少研究[20-22]報(bào)道PM2.5對(duì)心血管系統(tǒng)的影響。本實(shí)驗(yàn)從心肌細(xì)胞株角度出發(fā)，從另一個(gè)側(cè)面揭示了PM2.5對(duì)心血管系統(tǒng)的毒性作用。

線(xiàn)粒體普遍存在于真核細(xì)胞中，細(xì)胞生命活動(dòng)所需能量的80%來(lái)源于線(xiàn)粒體，是細(xì)胞進(jìn)行生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的主要場(chǎng)所。線(xiàn)粒體的主要功能是合成ATP。通過(guò)三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化，將糖類(lèi)、脂肪和氨基酸氧化并合成能量。此外，線(xiàn)粒體也是細(xì)胞活性氧（ROS）產(chǎn)生的重要基地。生理狀態(tài)下，線(xiàn)粒體產(chǎn)生少量的ROS，對(duì)細(xì)胞有利；在某些病理?xiàng)l件下，線(xiàn)粒體產(chǎn)生大量的ROS，導(dǎo)致細(xì)胞器、DNA及膜結(jié)構(gòu)等損壞，甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死[23]。有研究[24]顯示，線(xiàn)粒體ROS的產(chǎn)生與線(xiàn)粒體的膜電位密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5毒染的心肌細(xì)胞出現(xiàn)線(xiàn)粒體腫脹，線(xiàn)粒體嵴模糊，基質(zhì)凝固，明顯損害了線(xiàn)粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PM2.5毒染的心肌細(xì)胞內(nèi)ROS明顯增高，而線(xiàn)粒體的ATP酶活性卻下降，提示PM2.5破壞了線(xiàn)粒體的正常能量代謝，引起線(xiàn)粒體ATP酶活性不足，導(dǎo)致細(xì)胞能力障礙，同時(shí)產(chǎn)生大量的ROS，進(jìn)而損害細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能。更進(jìn)一步檢測(cè)線(xiàn)粒體的膜電位發(fā)現(xiàn)，PM2.5組線(xiàn)粒體膜電位明顯下降，這可能是PM2.5的毒性影響或者是細(xì)胞能量障礙和ROS產(chǎn)生過(guò)多損害了線(xiàn)粒體的內(nèi)外膜電勢(shì)所致。然而，到底是ROS產(chǎn)生過(guò)多導(dǎo)致了膜電位的改變，抑或膜電位的改變導(dǎo)致了ROS的產(chǎn)生，尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。PM2.5對(duì)線(xiàn)粒體的影響國(guó)內(nèi)外有少量研究[25-27]。PM2.5可以誘導(dǎo)Ⅱ肺泡上皮細(xì)胞（AECⅡ）通過(guò)線(xiàn)粒體途徑發(fā)生凋亡，導(dǎo)致AECⅡ增殖下降[28]；PM2.5引起上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)和膜電位異常改變，對(duì)線(xiàn)粒體和細(xì)胞造成損傷[29]；PM2.5可引起人肺腺癌A549細(xì)胞線(xiàn)粒體SDH活力下降，溶酶體ACP漏出增加，細(xì)胞膜通透性增加[30]。本研究從心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體角度出發(fā)，發(fā)現(xiàn)PM2.5對(duì)心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體的毒性作用機(jī)制，目前鮮見(jiàn)類(lèi)似報(bào)道。

綜上所述，PM2.5可導(dǎo)致大鼠心肌細(xì)胞的損害，這可能是由于PM2.5損害心肌細(xì)胞的線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)與功能所致。

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The preliminary study of the injury mechanism of rat cardiomyocytes caused by PM2.5 via mitochondria

ZHENG Gui-lang＊，LIAO Bao-nan，LIN Qian-wen.＊Department of Pediatrics，Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang 524000，China

Objective To investigate the toxicity of PM2.5 on the rat myocardial cells and the function of mitochondrial during the damage.Methods Rat cardiomyocytes H9C2 cell lines were cultured，after 24 hours of given PM2.5 stimulus，creatine kinase（CK）and lactate dehydrogenase（LDH）were detected.Mitochondrial reactive oxygen species （ROS）and ATP enzyme activity were determinated by colorimetric detection.Flow cytometry was used to analyze mitochondrial swelling and membrane potential.Results Compared with the NC group，CK and LDH were elevated（702±80）U/ml vs（987±92）U/ml，（339±72）U/ml vs（485±84）U/ml，ATP activity decreased（34.2±5.2）U/mgprot vs（54.1±6.9）U/mgprot，intracellular ROS increased（67.2±8.2）U/well vs（25.4±7.3）U/well，myocardial cell mitochondria were swollen significantly，membrane potential decreased greatly in the PM2.5 group（0.3476±0.1232 vs 0.6476±0.1021）.And the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion PM2.5 can lead to myocardial cell damage，which may be related to the structure and function of damaged mitochondrial caused by PM2.5.

PM2.5；Myocardial cells；Mitochondria；Mitochondrial membrane potential；ROS

湛江市非資助科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2013B01133）

524000 廣東省湛江市，廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)中心（鄭貴浪、林千文）；坡頭區(qū)官渡鎮(zhèn)衛(wèi)生院（廖保南）

10.3969/j.issn.1672－5301.2014.10.022

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2014）10-0939－05

2014-07-16）