吳小琴 曾志榮 許麗霞 曹清華 陳 斌 陳旻湖 胡品津

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化科1(510260) 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科2 病理科3

胃癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類生命。炎癥與癌癥關(guān)系密切，被列為癌癥的第七大特征[1]，而白細(xì)胞介素-17A(IL-17A)可能參與了炎癥相關(guān)腫瘤的形成。本課題組前期研究[2]發(fā)現(xiàn)，IL-17A G197A多態(tài)性與某些亞型胃癌的發(fā)生風(fēng)險增加有關(guān)。本研究通過分析IL-17A在胃癌組織中的表達(dá)，并探討體外IL-17A處理對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及其下游腫瘤相關(guān)炎性因子表達(dá)的影響，以期進(jìn)一步了解IL-17A與胃癌的關(guān)系。

材料與方法

一、標(biāo)本獲取

選取2004年7月～2005年6月于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院行胃癌根治術(shù)的54例胃癌患者的癌組織和16例相應(yīng)癌旁非癌組織(距離癌灶邊緣>3 cm)，所有標(biāo)本均經(jīng)HE染色病理檢查明確診斷。入選患者男33例，女21例，年齡41～72歲，平均(56.7±12.6)歲。所有患者手術(shù)前均未接受過放、化療。

二、細(xì)胞株、主要試劑

胃癌細(xì)胞株AGS、SGC7901、MKN45、MKN87、SUN1、SUN16購自美國ATCC公司，傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中(37 ℃，5%CO2)；山羊抗人IL-17A多克隆抗體、重組人IL-17A蛋白購自美國R&D公司；細(xì)胞總RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；RT-PCR和real-time PCR試劑盒購自日本TOYOBO公司；MTT和Annexin V-FITC試劑盒購自廣州展晨生物科技有限公司。

三、方法

1. 免疫組化法檢測IL-17A表達(dá)：以免疫組化SP法檢測胃癌組織和相應(yīng)癌旁非癌組織中的IL-17A表達(dá)和分布。組織切片脫蠟、水化，3% H2O2室溫封閉5～10 min，蒸餾水洗滌3次，置于10 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液中加熱20 min，PBS沖洗后加入山羊抗人IL-17A多克隆抗體(1∶400)，37 ℃孵育2 h，PBS沖洗后加入二抗，37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、中性樹膠封固后于光學(xué)顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知陽性切片作為陽性對照。IL-17A免疫組化染色陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈棕褐色。參考Zhang等[3]采用的方法，每例標(biāo)本選取5個視野(×400)計數(shù)陽性細(xì)胞，結(jié)果取均值。

2. RT-PCR法檢測IL-17A mRNA表達(dá)：取對數(shù)生長期胃癌細(xì)胞株AGS、SGC7901、MKN45、MKN87、SUN1、SUN16，以炎癥性腸病患者外周血單核細(xì)胞作為陽性對照，參照細(xì)胞總RNA提取試劑盒和RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作。IL-17A引物上游：5’-ACT CCT GGG AAG ACC TCA TTG-3’，下游：5’-GGC CAC ATG GTG GAC AAT CG-3’；GAPDH 引物上游：5’-TGG TCT CCT CTG ACT TCA AC-3’，下游：5’-GTG AGG GTC TCT CTC TTC CT-3’。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，上UVP GDS-7600 凝膠圖像成像系統(tǒng)檢測。

3. 細(xì)胞增殖檢測：取對數(shù)生長期SGC7901細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以9×103/孔接種于96孔板，培養(yǎng)4～6 h后，分別加入不同濃度(10、50、100 ng/mL)重組人IL-17A，對照組加入等體積DMSO，培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，棄上清液，加入DMSO 200 μL，低速振蕩10 min，以酶標(biāo)儀測定492 nm波長處各孔吸光度(A)值。細(xì)胞增殖率=實驗孔A值/對照孔A值×100%。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

4. 細(xì)胞凋亡檢測：取對數(shù)生長期SGC7901細(xì)胞，以5×104/孔接種于6孔板，加入含0.25 mmol/L H2O2的無血清RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h，PBS沖洗2次，換為含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，并加入不同濃度(0、10、100 ng/mL)重組人IL-17A，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，按Annexin V-FITC試劑盒說明書行細(xì)胞染色，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

5. real-time RT-PCR法檢測IL-6、基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13) mRNA表達(dá)：取對數(shù)生長期SGC7901細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞完全貼壁后，換為含不同濃度(0、10、100 ng/mL)重組人IL-17A的培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 h后收集細(xì)胞，參照細(xì)胞總RNA提取試劑盒和real-time PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作。IL-6引物上游：5’-TGT AGC CGC CCC ACA CA-3’，下游：5’-GGA TGT ACC GAA TTT GTT TGT CAA-3’；MMP-13引物上游：5’-GAA TTA AGG AGC ATG GCG ACT T-3’，下游：5’-CCC AGG AGG AAA AGC ATG AG-3’；β-actin引物上游：5’-GCA TGG GTC AGA AGG ATT CCT-3’，下游：5’-TCG TCC CAG TTG GTG ACG AT-3’。PCR反應(yīng)條件：93 ℃ 3 min；93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。以2-△△Ct法計算目的基因mRNA相對表達(dá)量。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、IL-17A在胃癌和癌旁非癌組織中的表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示，IL-17A陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕褐色顆粒樣，細(xì)胞核無陽性染色。胃癌組織中IL-17A呈散在分布，主要表達(dá)于炎性細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞；相應(yīng)癌旁非癌組織有少量炎性細(xì)胞表達(dá)IL-17A。胃癌組織中IL-17A陽性細(xì)胞數(shù)較相應(yīng)癌旁非癌組織顯著增多(P=0.007)(見圖1)。

二、IL-17A在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)

RT-PCR法檢測結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞株AGS、SGC7901、MKN45、MKN87、SUN1、SUN16中均無IL-17A mRNA表達(dá)(見圖2)。

A、B: 胃癌組織；C、D：癌旁非癌組織

圖2 IL-17A mRNA在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)

三、IL-17A對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，IL-17A能顯著刺激SGC7901細(xì)胞增殖，作用呈劑量和時間依賴性(見圖3)。

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，IL-17A 10、100 ng/mL組SGC7901細(xì)胞凋亡率較0 ng/mL 組顯著降低(P<0.05)，10、100 ng/mL組間凋亡率無明顯差異(P>0.05)(見圖4)。

四、IL-17A對胃癌細(xì)胞IL-6、MMP-13 mRNA表達(dá)的影響

real-time RT-PCR法檢測結(jié)果顯示，IL-17A 10、100 ng/mL組SGC7901細(xì)胞IL-6、MMP-13 mRNA表達(dá)水平較0 ng/mL組顯著上調(diào)，作用呈劑量依賴性(P<0.05)(見圖5)。

圖3 IL-17A對SGC7901細(xì)胞增殖的影響

圖4 IL-17A對SGC7901細(xì)胞凋亡的影響

圖5 IL-17A對SGC7901細(xì)胞IL-6、MMP-13 mRNA表達(dá)的影響

討 論

IL-17是一種炎性細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、多發(fā)性硬化、炎癥性腸病等多種炎癥性和自身免疫性疾病相關(guān)[4-5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，IL-17在多種腫瘤組織中表達(dá)異常。Miyahara等[6]的研究顯示，分離自卵巢癌組織的浸潤性T細(xì)胞中，表達(dá)IL-17的Th17細(xì)胞比例較正常組織顯著增高。Zhu等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中IL-17表達(dá)明顯升高，其主要表達(dá)于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、部分淋巴細(xì)胞以及多個核細(xì)胞，極少量表達(dá)于腫瘤細(xì)胞。Le Gouvello等[8]對結(jié)腸癌標(biāo)本的研究顯示，癌組織IL-17表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)正常組織。Zhang等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌組織中的IL-17表達(dá)水平顯著高于癌旁非癌組織，癌組織IL-17細(xì)胞密度與預(yù)后密切相關(guān)，有望成為預(yù)后指標(biāo)和治療靶點。

本研究分析了IL-17A在胃癌組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的IL-17A表達(dá)強(qiáng)度顯著高于癌旁非癌組織，主要表達(dá)于炎性細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，該發(fā)現(xiàn)提示IL-17A可能與腫瘤血管生成有關(guān)。Numasaki等[9]的研究顯示，IL-17可激發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，促進(jìn)脈管形成，調(diào)節(jié)促血管生成因子分泌，從而促進(jìn)腫瘤血管生成。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，體外重組人IL-17A可刺激胃癌細(xì)胞株SGC7901增殖，抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提示IL-17A可能參與了胃癌的惡性演變進(jìn)程。

IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、免疫防御等過程。MMP-13屬于間質(zhì)膠原酶類，具有強(qiáng)大的膠原蛋白降解能力，在基質(zhì)金屬蛋白級聯(lián)激活中起關(guān)鍵作用。IL-6和MMP-13在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。IL-6可通過JAK/STATs途徑活化STAT3，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和凋亡障礙，并可促進(jìn)腫瘤血管生成以及加劇腫瘤組織炎癥等[10]。MMP-13表達(dá)受 MAPK信號通路控制，后者是IL-17A信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路之一[11-12]。本研究結(jié)果證實，IL-17A可上調(diào)胃癌細(xì)胞中的IL-6和MMP-13表達(dá)，作用呈劑量依賴性，提示IL-6和MMP-13在IL-17A參與的胃癌發(fā)生機(jī)制中可能起一定作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL-17A在胃癌組織中呈高表達(dá)。體外IL-17A處理可刺激胃癌細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，并上調(diào)其腫瘤相關(guān)炎性因子IL-6、MMP-13表達(dá)。IL-17A可直接或通過誘導(dǎo)炎癥信號通路分子間接促進(jìn)胃癌進(jìn)展，有望成為胃癌治療的新靶點。然而，目前IL-17A在腫瘤微環(huán)境中的作用尚未完全明確，其確切作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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