劉志遠(yuǎn)，張愛(ài)臣，劉新濤，關(guān)曉俠，李玲玲，殷玉和

（1.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130012；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，長(zhǎng)春 130033）

異檸檬酸裂解酶肽類抑制劑結(jié)構(gòu)的修飾

劉志遠(yuǎn)1，張愛(ài)臣2，劉新濤1，關(guān)曉俠1，李玲玲1，殷玉和1

（1.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130012；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，長(zhǎng)春 130033）

利用Fmoc固相多肽合成法，按已知異檸檬酸裂解酶抑制劑的直鏈肽氨基酸序列合成首尾相連的環(huán)肽抑制劑.經(jīng)色譜純化和質(zhì)譜鑒定，其相對(duì)分子質(zhì)量的實(shí)測(cè)值與理論值相符.抑制率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，合成的環(huán)肽對(duì)異檸檬酸裂解酶有明顯抑制作用，抑制率大于50%.采用高效液相色譜法分別檢測(cè)直鏈肽和環(huán)肽在血漿中的半衰期，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，環(huán)肽在血漿中的半衰期為11min，比直鏈肽的半衰期延長(zhǎng)175%.

異檸檬酸裂解酶；肽類；抑制劑；環(huán)肽

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2－CTC樹脂、芴甲氧基羰基（Fmoc）－氨基酸（Fmoc－Pro－OH，F(xiàn)mocsn（Trt）－OH，F(xiàn)moc－Ser（tBu）－OH，F(xiàn)mocrg（Pbf）－OH）、Fmoc－Glu－Oallyl、苯并三氮唑－N，N，N′，N′－四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU）、1－羥基苯并三氮唑（HOBT）、N，N－二異丙基乙胺（DIEA）、三異丙基硅烷（TIS）和三氟乙酸（TFA）均為吉爾生化（上海）公司產(chǎn)品；N－甲基嗎啉（NMM）、四（三苯基膦）鈀（Pb（pph3）4）、茚三酮、二氯甲烷（DCM）、N，N二甲基甲酰胺（DMF）、六氫哌啶（哌啶，PIP）、無(wú)水乙醚、無(wú)水甲醇和無(wú)水乙醇均為北京化工廠產(chǎn)品.

PET28b－ICL菌種由長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)ICL抑制劑實(shí)驗(yàn)組提供，于－80℃冰箱保存.血漿由長(zhǎng)春市中心血站提供.

1.2 儀 器

循環(huán)水式真空泵（河南予華儀器有限公司）；離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；制備型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；恒溫培養(yǎng)搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）；凍干機(jī)（上海東富龍科技有限公司）；超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scitific公司，Namo Drop2000型）；電泳儀（上海捷邁科貿(mào)有限公司）；分析天平（沈陽(yáng)龍騰電子有限公司）；質(zhì)譜儀（德國(guó)Bruker公司）.

1.3 方 法

1.3.1 環(huán)肽的固相合成 根據(jù)直鏈肽肽序列中含有谷氨酸的特點(diǎn)，以及肽鏈?zhǔn)孜箔h(huán)化的要求，設(shè)計(jì)如圖1所示的固相合成環(huán)肽方法.

圖1 固相合成環(huán)肽流程Fig.1 Solid phase synthesis of cyclic peptide

1.3.2 環(huán)肽的分析、純化與分子量鑒定 用高效液相色譜分析環(huán)肽粗品，高效液相色譜分析條件：C18色譜柱（4.6nm×250nm）；流動(dòng)相A為V（H2O）∶V（TFA）＝1∶0.05，有機(jī)相B為V（乙腈）∶V（H2O）∶V（TFA）＝90∶10∶0.05；進(jìn)樣量為10μL，流速為1mL／min.

用制備型高效液相色譜儀純化環(huán)肽純品，制備條件：C18色譜柱（20nm×250nm）；流動(dòng)相A為V（H2O）∶V（TFA）＝1∶0.25；有機(jī)相B為V（乙腈）∶V（H2O）∶V（TFA）＝60∶40∶0.25；流速為10mL／min.將所得肽純品真空冷凍干燥后于－20℃冰箱保存?zhèn)溆?

利用質(zhì)譜儀測(cè)量高效液相色譜儀主峰產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量，檢測(cè)模式為反射模式.

1.3.3 ICL的提取 對(duì)菌種PET28b－ICL進(jìn)行增菌培養(yǎng)，當(dāng)OD值為0.6～0.8時(shí)，加入異丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）對(duì)ICL進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá).在誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體中加入菌體裂解液（50mmol Tris－HCl，pH＝8.0），吹勻菌體，于冰上攪拌30min后冰浴下超聲破菌至透明，靜置30min以上，以10 000r／min離心30min后，取上清液，用鎳離子螯合型瓊脂糖凝膠親和層析柱進(jìn)行純化.純化后的ICL蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）進(jìn)行鑒定分析.

1.3.4 合成環(huán)肽對(duì)ICL抑制作用的檢測(cè) 異檸檬酸在ICL的催化下生成琥珀酸和乙醛酸.乙醛酸可通過(guò)乳酸脫氫酶（LDH）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）還原為甘醇酸酯，其中NADH在340nm處的光吸收值最大.通過(guò)分析實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)NADH在340nm處光吸收值的變化可檢測(cè)ICL的酶活性.

在總體積為600μL反應(yīng)體系中加入一定量的3－（N－嗎啉基）丙磺酸（MOPS）緩沖液（50mmol／L MOPS，5mmol／L MgCl2，5mmol／L L－cysteine，1mmol／L EDTA，pH＝6.8）、純化蛋白ICL 50mL、LDH 10μL和NADH 40μL（2mmol），在37℃恒溫水浴中作用20min，加入100μL異檸檬酸（20mmol／L），用超微量分光光度計(jì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)340nm處的光吸收值.同時(shí)設(shè)不加酶和不加底物（異檸檬酸）的對(duì)照組.

向上述反應(yīng)體系中加入50μL合成的環(huán)肽，用超微量分光光度計(jì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)340nm處的光吸收值.抑制率計(jì)算公式為

1.3.5 合成環(huán)肽在血漿中的穩(wěn)定性檢測(cè) 將180μL乙腈沉淀后的血漿于37℃孵育5min.取20μL濃度為10－2mol／L合成的環(huán)肽置于正在孵育的血漿中，震蕩均勻后迅速取出20μL混合液置于離心管中，將其記為0min樣品，然后分別在5，10，15，20，25，30min各取出20μL樣品.

酶解過(guò)程的終止：在取出的樣品中加入90μL乙腈振蕩混勻后，將樣品置于冰上5min，再用90μL（體積分?jǐn)?shù)為0.5%）的冰醋酸稀釋終止酶解過(guò)程.以13 000r／min離心15min，取上清液，于－80℃冰存，以備高效液相色譜儀分析［14］.

高效液相色譜條件：C18色譜柱（4.6nm×250nm）；流動(dòng)相A為V（H2O）∶V（TFA）＝1∶0.05，有機(jī)相B為V（乙腈）∶V（H2O）∶V（TFA）＝90∶10∶0.05，洗脫梯度為5%～95%，進(jìn)樣量為10μL，流速為1mL／min.

由峰面積計(jì)算可得肽的質(zhì)量濃度ρ，將肽質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)（lgρ）和時(shí)間（t）進(jìn)行線性回歸，由回歸方程可得半衰期［5］為

2 結(jié)果與討論

2.1 環(huán)肽粗品的分析與純化

肽與樹脂分離后，在真空中干燥可得白色環(huán)肽粗品176mg，經(jīng)制備型高效液相色譜法（HPLC）純化，收集目標(biāo)產(chǎn)物峰真空冷凍干燥可得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.3%的肽純品25mg.肽純品HPLC的檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，分子結(jié)構(gòu)如圖3所示.純化后環(huán)肽的分子量為777.83，與目標(biāo)環(huán)肽相對(duì)分子質(zhì)量一致.

圖2 純化后環(huán)肽HPLC的檢測(cè)結(jié)果Fig.2 HPLC graph of the high purity cyclic peptide

圖3 目標(biāo)環(huán)肽分子結(jié)構(gòu)Fig.3 Molecular structure of the target cyclic peptide

2.2 ICL濃度檢測(cè)

將經(jīng)鎳離子螯合型瓊脂糖凝膠親和層析純化后的酶蛋白分裝在7支EP管中，對(duì)7支EP管中的酶蛋白進(jìn)行SDS－PAGE檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示.由圖4可見(jiàn)，5號(hào)EP管中蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，將其于－80℃冰存，以備酶活性檢測(cè).

2.3 ICL的酶活性實(shí)驗(yàn)

分別將直鏈肽與合成的環(huán)肽（5mg／mL）置于檢測(cè)酶活性的反應(yīng)體系中，總反應(yīng)時(shí)間為600s，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)NADH在340nm處的吸光度值.直鏈肽與環(huán)肽對(duì)ICL抑制作用的檢測(cè)結(jié)果如圖5所示.由圖5可見(jiàn)：在直鏈肽與ICL的反應(yīng)體系中，反應(yīng)時(shí)間為330s；在環(huán)肽與ICL的反應(yīng)體系中，反應(yīng)時(shí)間為410s；抑制率分別為55.5%和64.7%.

圖4 ICL的SDS－PAGE檢測(cè)結(jié)果Fig.4 SDS－PAGE graph of ICL

圖5 環(huán)肽和直鏈肽對(duì)ICL抑制作用的檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Inhibition effects of the cyclic peptide and the linear peptide on ICL

2.4 環(huán)肽在血漿中的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在血漿中分別加入質(zhì)量濃度均為2mg／mL的直鏈肽和環(huán)肽，直鏈肽和環(huán)肽在血漿中的半衰期如圖6所示.由圖6可見(jiàn)，直鏈肽和環(huán)肽的半衰期分別為4min和11min，即環(huán)化后的肽比直鏈肽的半衰期延長(zhǎng)175%.

圖6 直鏈肽（A）和環(huán)肽（B）在血漿中的半衰期Fig.6 Half－life of the linear peptide（A）and the cyclic peptide（B）

綜上可見(jiàn)，本文采用Fmoc固相合成法合成了首尾相連環(huán)肽［cyclo（Asn－Pro－Pro－Glurg－Ser－Pro）］，其分子量為777.83，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.3%，對(duì)ICL的抑制率為64.7%，半衰期為11min.

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（責(zé)任編輯：?jiǎn)?凝）

Modification of Isocitrate Lyase Peptide Inhibitor

LIU Zhiyuan1，ZHANG Aichen2，LIU Xintao1，GUAN Xiaoxia1，LI Lingling1，YIN Yuhe1
（1.School of Chemistry and Life Science，Changchun University of Technology，Changhun130012，China；2.China－Japan Union Hospital，Jilin University，Changhun130033，China）

Fmoc solid－phase peptide synthesis was used to synthesize cyclic peptide in light of the known isocitrate lyase linear peptide sequence according to the end to end way.Mass spectrometry demonstrates that the measured value of relative molecular mass is consistent with the theoretical value.Inhibition test confirms that the cyclic peptide shows significant inhibition to the ICL activity（the inhibition rate was more than 50%）.At the same time，half－life of linear peptide and that of cyclic peptide in plasma were measured by HPLC.Results indicate that half－life of cyclic peptide in plasma amounts to 11min，which is increased by 175%compared with that of linear peptide.

isocitrate lyase；peptide；inhibitor；cyclic peptide

Q78

A

1671－5489（2014）04－0847－05

結(jié)核?。╰uberculosis）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium）引起的慢性傳染病.結(jié)核桿菌被巨噬細(xì)胞吞噬后，在巨噬細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)為持留狀態(tài)，通過(guò)乙醛酸循環(huán)途徑獲取能量，維持其在宿主體內(nèi)的長(zhǎng)期持留存在［1］.異檸檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL）是乙醛酸循環(huán)中的關(guān)鍵限速酶之一，對(duì)結(jié)核桿菌維持其持留狀態(tài)起決定性作用［2］.氨基酸序列為NPPERSP的直鏈肽對(duì)異檸檬酸裂解酶有明顯抑制作用［3］.吳從梅等［4］利用噬菌體肽庫(kù)篩選技術(shù)與Fmoc固相合成法合成了對(duì)ICL具有抑制作用的直鏈肽；遲強(qiáng)等［5］將胸腺五肽合成胸腺五肽乙酯，使其在血漿中的半衰期由1.3min延長(zhǎng)至2min.由于直鏈肽藥物進(jìn)入體內(nèi)后可被酶迅速代謝降解，因此其半衰期較短.通過(guò)化學(xué)修飾可延長(zhǎng)多肽類藥物的半衰期［6］.

研究表明，將直鏈肽合成為環(huán)肽可提高多肽的活性和穩(wěn)定性［7］.在環(huán)肽合成中，固相合成法與液相合成法相比，能有效避免發(fā)生二聚和多聚等副反應(yīng)［8－10］.本文將直鏈肽NPPERSP進(jìn)行首尾相連環(huán)化，獲得了生物活性較高的環(huán)肽抑制劑［11－13］，并對(duì)合成的環(huán)肽分別進(jìn)行異檸檬酸裂解酶抑制率檢測(cè)和血漿中穩(wěn)定性的檢測(cè).

10.13413／j.cnki.jdxblxb.2014.04.42

2013－09－29.

劉志遠(yuǎn)（1987—），男，漢族，碩士研究生，從事生物制藥的研究，E－mail：124273183＠qq.com.通信作者：殷玉和（1972—），男，漢族，博士，講師，從事生物制藥的研究，E－mail：yyh72＠sina.com.

吉林省教育廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（批準(zhǔn)號(hào)：2009110）.