于 爽 察雪湘 吳 瑤 馮國(guó)清

(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，河南 鄭州 450052)

巴戟天糖鏈?zhǔn)前完齑继嵛锼苄圆糠种械闹饕行С煞?，研究發(fā)現(xiàn)在經(jīng)典成骨誘導(dǎo)組(地塞米松、維生素C和β-甘油磷酸鈉)中使用巴戟天水提取物和巴戟天醇提取物含藥血清能顯著促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化作用〔1〕。但巴戟天寡糖對(duì)成肌細(xì)胞增殖分化的研究，目前尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究巴戟天糖鏈誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、藥品與試劑、儀器 新生1～3 d SD大鼠(合格證號(hào)：410116)，雌雄不限，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。巴戟天(購(gòu)自廣東省德慶縣藥材公司，一等品，河南省藥品檢驗(yàn)所李杰鑒定) 生藥15 kg 粉碎后，分次用體積分?jǐn)?shù)為0.70的乙醇在90℃水浴中煮60 min，將乙醇提取液旋蒸回收乙醇，得濃縮液。用適量的蒸餾水稀釋后，分別用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，棄去乙醚、乙酸乙酯、正丁醇可溶部分，得到醇提物的水溶部分，用層析柱方法分離收集糖鏈部分，其純度為98.76%。Desmin抗體由武漢博士德公司出品；PCRKit(AMV)Ver.2.1試劑盒由TaKaRa 公司出品；200 bp DNA Ladder Marker；GATA-4、β-actin引物由上海生工公司合成。HERA cell二氧化碳培養(yǎng)箱(德國(guó)GmbH公司)，PCR擴(kuò)增儀(Sigma公司)；數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)(UVI公司)。

1.2方法

1.2.1乳鼠后肢骨骼肌成肌細(xì)胞的培養(yǎng)〔2〕無菌條件下剪取SD大鼠后肢骨骼肌，剪成1～2 mm3的碎塊，用含抗生素的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次靜置1 min并棄上層液。加入濃度為0. 05 %的Ⅱ型膠原酶，37 ℃消化約40 min，1 000 r/min離心10 min，棄上清，再加入0.125%胰蛋白酶，37 ℃消化30 min，立即加入少許PBS液中止消化， 1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入PBS液輕輕吹打，100目尼龍網(wǎng)過濾，收集濾液。1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基重懸。經(jīng)重懸的細(xì)胞移入培養(yǎng)瓶中，高密度接種，置37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱。90 min后，吸出上層液，離心計(jì)數(shù)，以1×105/ml細(xì)胞密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)采用培養(yǎng)的原代成肌細(xì)胞。

1.2.2成肌細(xì)胞鑒定 用Desmin 抗體對(duì)分裂增殖4～5 d的成肌細(xì)胞進(jìn)行間接免疫酶染色。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 分空白對(duì)照組、5-氮雜胞苷陽性藥對(duì)照組(10 μmol/ml)、巴戟天寡糖大、中、小(500、300和100 μg/ml)劑量組。

1.4觀察各組成肌細(xì)胞對(duì)異丙腎上腺素(IP)的反應(yīng) 取各組中具有自主跳動(dòng)的成肌細(xì)胞(融合的細(xì)胞團(tuán))視野，分別觀察加入IP前后(IP終濃度為0.1 μmol/ml)各組多個(gè)視野下搏動(dòng)的細(xì)胞團(tuán)，并計(jì)數(shù)細(xì)胞團(tuán)每分鐘搏動(dòng)的頻率(次/min)。

1.5RT-PCR法檢測(cè)各組成肌細(xì)胞心臟轉(zhuǎn)錄因子GATA-4 mRNA的表達(dá) Trizol提取細(xì)胞總RNA，參照TaKaRa PCR Kit(AMV)Ver.2.1試劑盒提供的條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，外引物序列：上游5'- AATCTCGATATGTTTGATGAC - 3' ；下游5'- GCTGCTGTGCCCATAGTGAG - 3' ;擴(kuò)增片段長(zhǎng)度528 bp。內(nèi)引物序列上游：5' CCTCTCCTGTGCCAACTGCC - 3' 下游：5'- GCTGCTGCTGCTGCTGG - 3'； ;擴(kuò)增片段長(zhǎng)度272 bp。巢式PCR擴(kuò)增GATA-4：第一輪引物反應(yīng)條件：94℃ 2 min，擴(kuò)增條件：94℃ 變性1 min,57℃退火1 min,72℃延伸2 min，25個(gè)循環(huán)。72℃，5 min,最后降至4 ℃取出，-20℃保存。第二輪引物反應(yīng)條件：94℃ 2min，擴(kuò)增條件：94℃ 變性1 min,63℃退火1 min,72℃延伸2 min,共30個(gè)循環(huán)。延伸條件：72 ℃，5 min,最后降至4℃取出，-20℃保存。選用β-actin作內(nèi)參，上游5'- AGG TGA GAG GGA AAT CGT GCG - 3'；下游 - 3'-CGTG TCA CGA CAG ACC GTG-5',擴(kuò)增片段長(zhǎng)度299 bp，反應(yīng)條件：預(yù)變性：94℃ 2 min， 擴(kuò)增條件：94℃ 變性30 s,51 ℃退火45 s,72℃延伸40 s。共32個(gè)循環(huán)。延伸條件：72℃，7 min,最后降至4℃取出，-20℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠行水平電泳，電泳條件：電壓5 V，30 min，溴乙錠顯色，用凝膠成像分析儀(UVI)觀察分析電泳結(jié)果。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1成肌細(xì)胞的鑒定 將分裂增殖4～5 d的成肌細(xì)胞用Desmin 抗體進(jìn)行間接免疫酶染色,成肌細(xì)胞desmin 胞質(zhì)呈陽性反應(yīng),細(xì)胞核外周及胞質(zhì)呈棕黃色;表明培養(yǎng)的細(xì)胞為成肌細(xì)胞。見圖1。

圖1 成肌細(xì)胞Desmin抗體染色陽性細(xì)胞 (×400)

2.2巴戟天糖鏈對(duì)IP誘發(fā)的成肌細(xì)胞自主搏動(dòng)反應(yīng)的影響 結(jié)果表明：各組成肌細(xì)胞搏動(dòng)對(duì)IP均有反應(yīng)，表明IP對(duì)成肌細(xì)胞有正性變時(shí)作用。與空白對(duì)照組相比，IP對(duì)巴戟天糖鏈小劑量組成肌細(xì)胞正性變時(shí)作用不明顯(P> 0.05)；而IP對(duì)巴戟天糖鏈中劑量組和巴戟天糖鏈大劑量組成肌細(xì)胞正性變時(shí)作用更加明顯(P<0.05)。與陽性藥組相比，IP對(duì)巴戟天糖鏈中劑量組和巴戟天糖鏈大劑量組成肌細(xì)胞正性變時(shí)作用更明顯(P<0.05)，提示巴戟天糖鏈具有誘導(dǎo)成肌細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的潛在可能。見表1。

表1 巴戟天糖鏈對(duì)IP誘發(fā)的成肌細(xì)胞自主搏動(dòng)反應(yīng)的影響

1：GATA-4(巴戟天糖鏈500 μg/ml)；2：β-actin(巴戟天糖鏈500 μg/ml)；3：GATA-4(巴戟天糖鏈300 μg/ml)；4：β-actin(巴戟天糖鏈 300 μg/ml)；5：GATA-4(巴戟天糖鏈 100 μg/ml)； 6：β-actin(巴戟天糖鏈 100 μg/ml)；7：GATA-4(空白對(duì)照)； 8：β-actin(空白對(duì)照)；9：GATA-4(5-氮雜胞苷10 μmol/ml)；10：β-actin(5-氮雜胞苷10 μmol/ml)；11： Marker

2.3巴戟天糖鏈對(duì)大鼠成肌細(xì)胞GATA-4 mRNA表達(dá)的影響 巢式PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，可分別于272 bp (GATA-4) 、299 bp(β-actin)見到條帶(圖2)，與設(shè)計(jì)引物相符。半定量RT-PCR結(jié)果提示: 空白對(duì)照組成肌細(xì)胞，未見GATA-4 mRNA的表達(dá)；而陽性藥對(duì)照組及巴戟天糖鏈的小、中、大劑量組均出現(xiàn)了GATA-4 mRNA的表達(dá)(0.51±0.04、0.67±0.11、0.84±0.06、1.02±0.08)；與陽性藥對(duì)照組相比，巴戟天糖鏈小、中、大三個(gè)各劑量組均可明顯上調(diào)GATA-4 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，并隨劑量增加表達(dá)增強(qiáng)。

3 討 論

心肌梗死后存活心肌細(xì)胞數(shù)量下降而導(dǎo)致最終的心功能不全已成為心肌梗死患者預(yù)后死亡的主要原因。細(xì)胞移植技術(shù)，為心肌壞死區(qū)的細(xì)胞重建及衰竭心臟的功能恢復(fù)，提供了一種全新的治療策略〔3〕。骨骼肌成肌細(xì)胞是首先被應(yīng)用于臨床試驗(yàn)、并在臨床試驗(yàn)中研究最多的移植細(xì)胞〔4〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：巴戟天糖鏈具有誘導(dǎo)成肌細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的潛在可能。原因在于巴戟天寡糖刺激了成肌細(xì)胞膜上“β受體”的表達(dá)，從而增強(qiáng)了成肌細(xì)胞對(duì)IP的反應(yīng)。如進(jìn)行心肌內(nèi)移植時(shí)，巴戟天糖鏈誘導(dǎo)后的成肌細(xì)胞可望改善心肌的收縮性，加強(qiáng)心臟的收縮力。但如何解決成肌細(xì)胞自主收縮頻率與心肌細(xì)胞的差異，有待進(jìn)一步研究。

GATA家族是含有鋅指結(jié)構(gòu)的一組轉(zhuǎn)錄因子，具有結(jié)合核酸共同序列(A/T)GATA(A/G)的特性。其中GATA-4是目前研究較多的與心臟發(fā)育密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，參與了心臟正常發(fā)育、功能基因表達(dá)的過程。GATA-4是某些心肌特異性基因的高效轉(zhuǎn)錄激活因子，也是心肌特異性基因時(shí)序性表達(dá)過程中一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控因子〔5〕。在胚胎發(fā)育中，可以在心肌祖細(xì)胞中檢測(cè)到GATA-4的表達(dá)。

巴戟天寡糖可誘導(dǎo)成肌細(xì)胞出現(xiàn)心臟轉(zhuǎn)錄因子GATA-4 mRNA的表達(dá)，并成一定的劑量相關(guān)性。巴戟天寡糖誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化過程中，可能發(fā)揮了某些心血管方面的藥理活性，使得誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞可表達(dá)GATA-4 mRNA，其機(jī)制可能是通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶使GATA-4磷酸化，或者是通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3-kinase)激活通路來激活GATA-4，使GATA-4轉(zhuǎn)錄活性增高〔6〕。巴戟天寡糖誘導(dǎo)成肌細(xì)胞是否有GATA-4蛋白的表達(dá)，是否有心臟其他特有的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，有待進(jìn)一步深入研究。

4 參考文獻(xiàn)

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