鏈霉菌I06A-03304產(chǎn)生的二酮哌嗪類化合物的純化及結(jié)構(gòu)鑒定

蔣忠科++++++張洋++++++郭連宏++++++姜蓉++++++孫承航

[摘要] 目的 分離鑒定鏈霉菌I06A-03304發(fā)酵液中具血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2胞內(nèi)酪氨酸激酶（VEGFR2-CD）抑制活性的次生代謝產(chǎn)物。 方法 采用大孔吸附樹脂、羥丙基葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20）、C-18反相色譜（ODS）、高壓液相色譜（HPLC）等分離手段對次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化；通過二級(jí)質(zhì)譜（ESI+-MS2）、紫外光譜（UV）、紅外光譜（IR）、核磁共振波譜（NMR）對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測其次生代謝產(chǎn)物對VEGFR2-CD的抑制活性。 結(jié)果 分離得到兩個(gè)二酮哌嗪類化合物：3304A和3304C；化合物3304A的化學(xué)結(jié)構(gòu)與環(huán)（脯氨酸-亮氨酸）一致，化合物3304C的化學(xué)結(jié)構(gòu)與環(huán)（脯氨酸-苯丙氨酸）一致，均對VEGFR2-CD表現(xiàn)出一定的抑制活性。 結(jié)論 化合物3304A和3304C是具有VEGFR2-CD抑制活性的二酮哌嗪類次生代謝產(chǎn)物，并為本研究首次報(bào)道。

[關(guān)鍵詞] 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2胞內(nèi)酪氨酸激酶；鏈霉菌；二酮哌嗪；拮抗劑

[中圖分類號(hào)] R96[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1673-7210（2014）06（c）-0004-05

Isolation, purification and structural identification of diketopiperazines produced by streptomyces strain I06A-03304

JIANG Zhongke ZHANG Yang GUO Lianhong JIANG Rong SUN Chenghang

Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

[Abstract] Objective To discover antagonists of VEGFR2-CD from the fermentation broth produced by streptomyces strain I06A-03304. Methods Under guidance of ELISA assay against VEGFR2-CD, compounds 3304A and 3304C were isolated and purified by HP-20 absorption resin, Sephadex LH-20 gel, ODS reversed-phase chromatography and semi-preparative HPLC. The structures of compounds 3304A and 3304C were identified by combination of analysis of UV, IR, ESI+-MS2 and NMR. Results Compounds 3304A and 3304C were purified and structurally identified as diketopiperazines, and were the same with cyclo-(Pro-Leu) and cyclo-(Pro-Phe) respectively. Compounds 3304A and 3304C showed weak antagonistic activity against VEGFR2-CD by ELISA assay. Conclusion For the first time, it is reported diketopiperazine compounds 3304A and 3304 C have antagonistic activity against VEGFR2-CD.

[Key words] VEGFR2-CD; Streptomyces; Diketopiperazines; Antagonist鏈霉菌屬是主要的抗生素產(chǎn)生菌，該屬微生物能合成具有各種生物活性的結(jié)構(gòu)多樣的次生代謝產(chǎn)物，是微生物藥物的重要源泉[1]。VEGFR2是介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）活性的主要受體，VEGFR2拮抗劑能抑制VEGF活性，從而達(dá)到有效抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的目的[2-3]。因此，以VEGFR2為靶點(diǎn)開發(fā)抗腫瘤藥物是重點(diǎn)研究的方向，目前已有Sorafenib、Sunitinib、Pazopanib等藥物上市[4]。VEGFR2-CD是具有受體酪氨酸激酶活性的VEGFR2胞內(nèi)區(qū)，來自Genshi等[5]和Solowiej等[6]的研究結(jié)果表明，以VEGFR2-CD替代VEGFR2進(jìn)行高通量篩選VEGFR2的抑制劑是可行的。目前，微生物來源的VEGFR2抑制劑報(bào)道較少，因此，以VEGFR2-CD為靶點(diǎn)對微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行高通量篩選，進(jìn)而快速發(fā)現(xiàn)微生物來源的VEGFR2的抑制劑，為開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供先導(dǎo)化合物，同時(shí)研究結(jié)果也將為該類微生物藥物的開發(fā)提供有益的借鑒。前期筆者以VEGFR2-CD為靶點(diǎn)對鏈霉菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩選，獲得了一株陽性鏈霉菌株：I06A-03304。本研究對鏈霉菌 I06A-03304產(chǎn)生的活性二酮哌嗪類化合物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其對VEGFR2-CD的拮抗活性進(jìn)行報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株鏈霉菌I06A-0334來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所（以下簡稱“本所”）菌種篩選中心，菌種由本所生物工程室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基鏈霉菌I06A-03304的種子和發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5 g，麥芽浸粉5 g，牛肉浸膏5 g，玉米漿4 g，蛋白胨5 g，淀粉20 g，黃豆餅10 g，碳酸鈣4 g，蒸餾水1 L，pH = 7.1；鏈霉菌I06A-03304的斜面ISP2（YM）培養(yǎng)基：麥芽浸粉10 g，酵母粉4 g，葡萄糖4 g，瓊脂12 g，蒸餾水1 L，pH 7.1。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑甲醇、三氟乙酸、丙酮、乙酸乙酯、氯化鈉（北京化工廠，分析純）；乙腈（美國SK Chemicals 公司，HPLC級(jí)）；Poly（E4Y）、Na3VO4、Tween-20、重組KDR-CD（美國Sigma公司）；辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗小鼠lgG（H+L）抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；小鼠磷酸化的酪氨酸抗體（PY99）（美國Santa Cruz Biotechnology公司）；MTT（北京中山生物技術(shù)有限公司）；辣根過氧化酶顯色底物TMB/H2O2 （中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所）；PBS緩沖液：Na2HPO4 0.363%、KH2PO4 0.024%、NaCl 0.8%、KCl 0.02%，pH = 7.4；PBST緩沖液：0.1% Tween-20 的PBS緩沖液。

1.1.4 分離填料Sephadex LH-20（瑞典Pharmacia公司，上海化學(xué)試劑廠分裝）、XAD-5型大孔吸附樹脂（天津南開大學(xué)化工廠）；ODS/C18 柱色譜介質(zhì)（日本Shimadzu公司）；HPLC分析柱：Zorbax SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）和HPLC半制備柱：Zorbax SB-C18（9.4 mm×250 mm，5 μm）均為美國安捷倫公司產(chǎn)品。

1.1.5 儀器酶標(biāo)比色儀（Bio-Rad 680，美國）；高壓液相色譜儀（Agilent 1200，美國）；紫外分光光度計(jì)（島津 UV2550，日本）；低速離心機(jī)（北京科瑞公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（步琪Buchi-011，瑞士）；質(zhì)譜儀（賽默飛世爾 LTQ-Orbitrap，美國）；傅里葉變換紅外光譜圖儀（熱電公司 Nicolet 5700，美國）；真空冷凍干燥機(jī)（愛德華 Modulyo，英國）；核磁共振儀（瓦里安VNS-600型600M，瑞士）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的發(fā)酵將生長良好的菌株I06A-03304斜面接種于含50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL 三角燒瓶中，在 28℃、250 r/min搖床上旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)48 h，然后按5%的接種量轉(zhuǎn)接于含100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，28℃、180 r/min搖床上旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)96 h，收獲發(fā)酵液。

1.2.2 活性檢測方法[7]化合物的VEGFR2-CD拮抗活性測定運(yùn)用ELISA法。采用10倍稀釋法，獲得化合物3304A、3304C濃度為10、1、0.1、0.01、0.001 mg/mL的樣品。本實(shí)驗(yàn)中設(shè)立樣品空白對照，抑制率（%）=[1-（A450樣品/A450空白對照）]×100%。

1.2.3 化合物3304A和3304C的分離純化將30 L發(fā)酵液過濾，濾液通過XAD-5型大孔樹脂，收集流出液，再分別用20%、80%丙酮水2倍體積洗脫，對洗脫組分進(jìn)行活性檢測，將具有VEGFR2-CD抑制活性的80%丙酮水部分減壓濃縮，用少量60%甲醇溶解，上樣于Sephadex LH-20柱，60%甲醇水洗脫，收集橘黃色的活性帶，得橘黃色粗品A。將粗品A用少量25%甲醇水溶解，上樣于ODS反相柱，以25%、50%、80%、100%甲醇水2倍柱體積梯度洗脫?；钚越M分集中在50%甲醇水洗脫部分，將該部分樣品減壓濃縮得半純品B。將B用少量30%乙腈溶解，用半制備HPLC進(jìn)行制備（流動(dòng)相：20%乙腈水，流速：1 mL/m，檢測波長：215 nm），收集保留時(shí)間分別為25.5、29.5 min的活性峰，冷凍干燥得純品3304A（12.0 mg）、3304C（3.3 mg）。用HPLC對所得化合物進(jìn)行純度檢測（流動(dòng)相：30%乙腈水，流速：0.5 mL/m，檢測波長：215 nm），3304A、3304C 的保留時(shí)間分別為8.8、9.9 min，純度分別為94.1% 和94.2%。

2 結(jié)果

2.1 化合物3304A的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)鑒定

化合物3304A為白色無定型粉末，易溶于乙腈、甲醇和二甲基亞砜（DMSO），不溶于環(huán)己烷，微溶于水?；衔?304A在甲醇溶液中的紫外光譜（UV）呈末端吸收。IR在3434、2951、2876、1670、1634和1434 cm-1 處有較強(qiáng)吸收，比旋光度為-137.5°（濃度為0.48 mg/mL，乙醇）。1H-NMR（CDCl3， 600 Mz）δ：3.52~3.62（2H，m，3-H），1.85~1.94（1H，m，4a-H），1.99~2.03（1H，m，4b-H），2.10~2.16（1H，m，5a-H），2.32~2.37（1H，m，5b-H），4.10~4.13（1H，m，6-H），4.00~4.02（1H，m，9-H），1.49~1.54（1H，m，10a-H），2.05~2.09（1H，m，10b-H）， 1.68-1.76 （1H， m，11-H ），0.95 （3H，J = 6.6，12-H），1.00 （ 3H，J = 6.6，13-H），5.82（1H，s，N-H）；13C-NMR（CDCl3，150 Mz ）δ：166.11（C-1），45.50（C-3），22.73（C-4），28.11（C-5），58.97（C-6），170.06（C-7），53.36（C-9），38.62（C-10），24.73（C-11），21.17（C-12），23.28（C-13）。

3304A的ESI-MS（+）顯示其準(zhǔn)分子離子峰為211（M+H）+，233（M+Na）+；所以可以確定該化合物的分子量為210?；衔?304A的IR圖譜顯示3434 cm-1處有一吸收峰，揭示其分子結(jié)構(gòu)中含有羥基、羧基或氨基活潑氫，1670、1643 cm-1為碳碳或碳氧雙鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰。所以從IR圖可看出分子結(jié)構(gòu)中含有活潑氫及雙鍵。1H-NMR譜中δ 5.82，顯示可能有一個(gè)酰胺氫（NH）存在；從13C-NMR 可知化合物3304A含有11個(gè)碳原子，其中δ 170.06和166.11 可能為酰胺碳，δ 58.97和53.36則可能為酰胺羰基的α碳的化學(xué)位移。再結(jié)合其紫外光譜呈末端吸收的特點(diǎn)，推測3304A為由兩個(gè)氨基酸組成的二酮哌嗪類化合物。

氨基酸組成的二酮哌嗪類化合物的MS2譜具有特征的碎片離子峰，可以對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定[8]?；衔?304A的ESI+-MS2圖顯示主要有m/z 211.1、183.2、154.1、138.1、114.1、98.1、70.0 等峰。見圖1。

圖1 化合物3304A的ESI+-MS/MS圖

m/z 98.1為脯氨酸殘基的特征離子峰，m/z 70.0為脯氨酸殘基斷裂酰胺羰基的峰，進(jìn)一步印證了脯氨酸殘基的存在，m/z 114.1可能為亮氨酸或異亮氨酸殘基的離子峰，m/z 183.2為母離子斷裂酰胺羰基的峰。根據(jù)1H-NMR譜中δ 0.95和1.00的兩個(gè)甲基氫均裂分為二重峰，可以推斷另一氨基酸為亮氨酸。綜合以上信息，可以確定化合物3304A為脯氨酸和亮氨酸組成的環(huán)二肽，其可能的裂解示意圖見圖2。

此外，查閱文獻(xiàn)[9]顯示，3304A的1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)與環(huán)（脯氨酸-亮氨酸）的1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)幾乎完全一致；其比旋光度為-137.5°，和文獻(xiàn)報(bào)道的很接近，所以確定 3304A為已知的二酮哌嗪類化合物：環(huán)（脯氨酸-亮氨酸），結(jié)構(gòu)見圖3。

2.2 化合物3304C的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)鑒定

化合物3304C冷干品呈黃色粉末，易溶于甲醇、乙腈和DMSO，不溶于環(huán)己烷，微溶于水。甲醇溶液中的紫外光譜（UV）在284 nm處有最大吸收。IR在3265、2961、1689、1663、1455、750和701 cm-1處有較強(qiáng)吸收。1H-NMR（CDCl3，600 Mz）δ：4.27（1H，dd，J=2.4，10.2，3-H），4.07（1H，t，J=7.8，6-H），2.75~2.80（1H，m，1'a-H），3.61~3.63（1H，m，1'b-H），5.62 （1H，s，N-H），7.22~7.36（5H，m，3'、4'、5'、6'、7'-H），3.55~3.58（1H，m，1''a-H），3.64~3.67（1H，m，1''b-H），1.88~1.94（1H，m，2''a-H），2.02~2.05（1H，m，2''b-H），1.97~2.00（1H，m，3''a-H），2.31~2.35（1H，m，3''b-H）；13C-NMR（CDCl3，150 Mz）δ：169.35（C-1），56.15（C-3），165.04（C-4），59.12（C-6），36.77（C-1'），135.92（C-2'），129.08（C-3'、C-7'），129.28（C-4'、C-6'），127.55（C-5'），45.45（C-1''），22.54（C-2''），28.34（C-3''）。

3304C 的ESI-MS（+）顯示該化合物的準(zhǔn)分子離子峰為245（M+H）+。化合物3304C的IR圖譜中1689、1663 cm-1為碳碳或碳氧雙鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰；1455~1600 cm-1之間存在吸收峰，結(jié)合3061 cm-1的吸收峰，說明分子中可能存在苯環(huán)，750和701cm-1的吸收峰則說明苯環(huán)可能為單取代結(jié)構(gòu)。3304C的1H-NMR譜中δ5.61，顯示可能有1個(gè)酰胺氫（NH）存在，在δ7.22~7.36有5個(gè)氫，進(jìn)一步印證了分子中含有一個(gè)單取代苯環(huán)。13C-NMR分析可知分子中含有14個(gè)碳原子，其中δ169.35和165.04可能為酰胺碳的化學(xué)位移，δ56.15，59.12則可能為酰胺羰基的α碳的化學(xué)位移，δ135.92，127.55，129.08×2，129.28×2則為單取代苯環(huán)碳的化學(xué)位移。根據(jù)以上信息，推測3304C也為由兩個(gè)氨基酸組成的二酮哌嗪類化合物。

通過對化合物3304C的ESI+-MS2解析，確定了化合物的氨基酸組成。ESI+-MS2圖顯示主要有m/z 245.1、217.1、172.1、154.1、120.1、98.1、70.0等峰見圖4。

圖4 化合物3304C的ESI+-MS/MS圖

從m/z 98.1和m/z 70.0推斷其中1個(gè)氨基酸為脯氨酸；m/z 120.1可能為苯丙氨酸殘基斷裂酰胺羰基的離子峰，再結(jié)合m/z 154.1為分子離子峰斷裂苯亞甲基的離子峰，可以推斷另一氨基酸為苯丙氨酸。綜合以上信息，可以確定化合物 3304C 為脯氨酸和苯丙氨酸組成的環(huán)二肽，其可能的裂解示意圖見圖5。

圖5 化合物3304C的ESI+-MS2 主要離子峰裂解示意圖

此外，文獻(xiàn)調(diào)研[10]顯示，3304C的1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)與環(huán)（脯氨酸-苯丙氨酸）的1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)幾乎完全一致；進(jìn)一步驗(yàn)證了ESI+-MS2解析的結(jié)果，其平面結(jié)構(gòu)見圖6。

圖 6化合物3304C的平面結(jié)構(gòu)

2.3 化合物3304A和3304C的VEGFR2-CD抑制活性

應(yīng)用ELISA法檢測3304A和3304C對VEGFR2-CD的抑制活性，3304A的抑制活性分別為：27.8%、21.9%、0、0、0、0；3304C的抑制活性分別為54.3%、19.3%、15.4%、0、0、0。由以上結(jié)果可知：3304A和 3304C均對VEGFR2-CD有一定的抑制活性，而且其抑制活性呈濃度依賴性。

3 討論

二酮哌嗪類化合物也稱二氧哌嗪，包括2，5-二酮哌嗪和2，3-二酮哌嗪。環(huán)二肽類化合物就屬于2，5-二酮哌嗪類，具有多種生物活性，包括抑菌、抗腫瘤、抗動(dòng)脈硬化、保護(hù)神經(jīng)元、改善腦功能以及脫癮、解毒等[11-12]，是自然界中最小的環(huán)肽。3304A為環(huán)（脯氨酸-亮氨酸），3304C為環(huán)（脯氨酸-苯丙氨酸）。文獻(xiàn)報(bào)道[13-14]，環(huán)（脯氨酸-亮氨酸）和環(huán)（脯氨酸-苯丙氨酸）對溫敏型小鼠乳腺癌細(xì)胞tsFT210具有一定的抑制活性，其中環(huán)（脯氨酸-亮氨酸）在500 μg/mL濃度下，抑制率為43.89%，環(huán)（脯氨酸-苯丙氨酸）在5 μg/mL濃度下，抑制率為13.1%。本文首次報(bào)道了環(huán)（脯氨酸-亮氨酸）和環(huán)（脯氨酸-苯丙氨酸）的VEGFR2-CD抑制活性。根據(jù)李德海等[13]的研究報(bào)道，該類化合物的體外抗腫瘤活性在5~100 μg/mL范圍內(nèi)不具有濃度依賴性，所以對其抗腫瘤作用和VEGFR2-CD抑制活性之間的關(guān)系還需進(jìn)一步研究，但3304A和3304C的VEGFR2-CD抑制活性結(jié)果可以對二酮哌嗪類化合物的抗腫瘤機(jī)制研究提供一些啟示。

鏈霉菌作為抗生素的主要來源，許多重要的臨床抗生素均來源于鏈霉菌（如鏈霉素、紅霉素、阿霉素、絲裂霉素、林可霉素、四環(huán)素等），一直是微生物藥物學(xué)家關(guān)注的重點(diǎn)[15]。第一個(gè)來自鏈霉菌的抗生素是美國Waksman研究組1942年發(fā)現(xiàn)的鏈絲菌素[16]，隨后該研究組在1944年又從鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了具有歷史意義的鏈霉素，該研究成果極大地激發(fā)了科學(xué)家從鏈霉菌屬微生物中尋找新抗生素的興趣[17]。鏈霉菌屬來源的抗生素?cái)?shù)量在20世紀(jì)70年代達(dá)到最高峰，之后每年從鏈霉菌屬發(fā)現(xiàn)的新抗生素逐漸減少，尤其是進(jìn)入20世紀(jì)90年代后，來自于鏈霉菌的抗生素急劇減少，發(fā)現(xiàn)新的抗生素越來越難。但Watve等[18]研究認(rèn)為，鏈霉菌屬的抗生素產(chǎn)生潛力還遠(yuǎn)未挖掘出來，目前所發(fā)現(xiàn)的抗生素僅占3%左右，并認(rèn)為抗生素發(fā)現(xiàn)的下降是由于篩選方法不足造成的，采用經(jīng)典的篩選方法會(huì)重復(fù)發(fā)現(xiàn)已知的抗生素。如何挖掘鏈霉菌屬這一抗生素資源寶庫，除了開發(fā)新的篩選模型之外，另外一個(gè)需要重點(diǎn)關(guān)注的是已知抗生素的早期排重，如環(huán)二肽類化合物就可以用MS2結(jié)合數(shù)據(jù)庫進(jìn)行早期微量鑒別，微量在線分析水平（LC-MS、LC-MSn、LC-NMR等）的提升也有助于化合物的早期排重。

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[13]李德海，顧謙群，朱偉明，等.海洋放線菌11014中抗腫瘤活性成分的研究I.環(huán)二肽[J].中國抗生索雜志，2005， 30（8）：449-452.

[14]趙文英，朱天驕，古靜燕，等.海洋來源放線菌3275化學(xué)成分及抗腫瘤活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006， 18：405-407，417.

[15]張致平.微生物藥物學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002： 188-383.

[16]Waksman SA，Woodruff HB. Streptothricin，a new selective bacteriostatic and bactericidal agent particularly against Gram-negative bacteria [J]. Proc Soc Exptl Biol Med，1942， 49：207-209.

[17]Waksman SA. Streptomycin：background，isolation，properties，and utilization [Z]. Nobel Lecture，1952：370-388.

[18]Watve MG，Tickoo R，Jog MM，et al. How many antibiotics are produced by the genus Streptomyces [J]. Arch Microbiol，2001，176：386-390.

（收稿日期：2014-03-06本文編輯：程銘）

[7]劉春平.人血管內(nèi)皮生長因子受體-2基因（KDR）在鏈霉菌和大腸桿菌的克隆表達(dá)及其抑制劑篩選模型的構(gòu)建研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2007.

[8]Furtado NA，Vessecchi R，Tomaz JC，et al. Fragmentation of diketopiperazines from Aspergillus fumigatus by electrospray ionization tandem mass spectrometry（ESI-MS/MS）[J]. J Mass Spectrom，2007，42：1279-1286.

[9]康潔，陳若蕓.構(gòu)菌發(fā)酵菌絲體化學(xué)成分的研究[J].中國中藥志，2003，28（11）：1038-1039.

[10]Fdhila F，Vaázquez V，Saánchez JL，et al. DD-Diketopiperazines： Antibiotics Active against Vibrio anguillarum Isolated from Marine Bacteria Associated with Cultures of Pecten maximus [J]. Journal of Natural Products，2003，66（10）：1200-1301.

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（收稿日期：2014-03-06本文編輯：程銘）

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[13]李德海，顧謙群，朱偉明，等.海洋放線菌11014中抗腫瘤活性成分的研究I.環(huán)二肽[J].中國抗生索雜志，2005， 30（8）：449-452.

[14]趙文英，朱天驕，古靜燕，等.海洋來源放線菌3275化學(xué)成分及抗腫瘤活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006， 18：405-407，417.

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[17]Waksman SA. Streptomycin：background，isolation，properties，and utilization [Z]. Nobel Lecture，1952：370-388.

[18]Watve MG，Tickoo R，Jog MM，et al. How many antibiotics are produced by the genus Streptomyces [J]. Arch Microbiol，2001，176：386-390.

（收稿日期：2014-03-06本文編輯：程銘）