李瑾昱，焦順昌，張國慶，孫勝杰

中國人民解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，北京 100853

表皮生長因子受體表達水平對西妥昔單抗及其介導的抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用殺傷肺腺癌A549細胞的影響

李瑾昱，焦順昌，張國慶，孫勝杰

中國人民解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，北京 100853

目的探討表皮生長因子受體 (EGFR)表達水平對西妥昔單抗及其介導的抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用 (ADCC)對肺腺癌A549細胞殺傷的影響。方法以肺腺癌A549細胞作為靶細胞，NKTm細胞作為效應(yīng)細胞，將pEGFR-EGFP質(zhì)粒用核轉(zhuǎn)染技術(shù)導入A549細胞，免疫組織化學法檢測轉(zhuǎn)染組與野生組A549細胞表面EGFR蛋白的表達水平。采用細胞計數(shù)試劑盒-8法檢測西妥昔單抗以及西妥昔單抗介導的ADCC作用對轉(zhuǎn)染后A549細胞與野生組A549細胞的體外殺傷率。結(jié)果免疫組織化學結(jié)果顯示，野生組A549細胞EGFR表達呈弱陽性，而轉(zhuǎn)染后的A549細胞EGFR表達呈強陽性。西妥昔單抗介導的ADCC作用對轉(zhuǎn)染后高表達EGFR的A549細胞具有更強的殺傷作用 (P＜0．05)，而西妥昔單抗單獨作用時，轉(zhuǎn)染組與野生組間的殺傷率差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0．05)。結(jié)論細胞表面EGFR蛋白的表達水平能夠影響西妥昔單抗介導的ADCC作用對肺腺癌A549細胞的殺傷，而對西妥昔單抗本身的殺傷作用無影響。

西妥昔單抗;非小細胞肺癌;表皮生長因子受體

Acta Acad Med Sin，2014，36(2)：164-167

西妥昔單抗是抗表皮生長因子受體 (epidermal growth factor receptor，EGFR)人/鼠嵌合型lgG1單克隆抗體，可以通過阻斷內(nèi)源性配體介導的EGFR信號傳導通路抑制腫瘤的生長。此外，西妥昔單抗還能夠通過發(fā)揮抗體依賴的細胞介導的細胞毒 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)作用介導淋巴細胞釋放細胞因子及胞內(nèi)毒性物質(zhì)，殺傷腫瘤細胞［1］。大規(guī)模臨床研究證實與單純化療相比，聯(lián)合西妥昔單抗能夠延長患者的總生存期［2-3］。然而作為靶向藥物的西妥昔單抗在非小細胞肺癌的治療中尚缺乏有效的療效預測指標。EGFR是西妥昔單抗發(fā)揮抗腫瘤作用的關(guān)鍵，研究表明腫瘤細胞高表達EGFR的非小細胞肺癌患者，在一線化療方案中加用西妥昔單抗可能取得更好的療效［4-5］。但EGFR表達水平是否真的能夠預測西妥昔單抗聯(lián)合化療的療效仍需前瞻性臨床試驗驗證。本研究在細胞水平上探討EGFR表達水平對西妥昔單抗以及其介導的ADCC作用殺傷肺癌細胞的影響。

材料和方法

材料西妥昔單抗注射液 (德國默克公司);RPMI-1640培養(yǎng)基、無菌磷酸鹽緩沖液、胎牛血清(美國GIBCO公司);胰蛋白酶-EDTA消化液 (美國AMRESCO公司);細胞計數(shù)試劑盒-8(日本Dojindo laboratories公司);DH5α(美國GIBICO公司);細胞核轉(zhuǎn)染試劑盒T(德國Amaxa Biosystems公司)。HERA Safe KS-12型生物安全柜、HERA Cell 240型CO2細胞培養(yǎng)箱、SORVALL LEGEND MACH 1．6R 離心機、Multiskan MK3酶標儀 (美國Thermo公司);Olympus BX41正置顯微鏡、Olympus CKX41倒置顯微鏡 (日本Olympus公司);Cytometer FC 500 MPL流式細胞儀(美國 BECKMAN公司);Veriti 96well梯度 PCR儀(Applied Biosystems公司);Amaxa Nucleofector system電轉(zhuǎn)儀 (德國 Amaxa Biosystems公司)。人肺腺癌A549細胞為我室常規(guī)凍存;NKTm細胞由中國人民解放軍總醫(yī)院腫瘤中心實驗室林星石教授培養(yǎng)并提供;pEGFR-EGFP質(zhì)粒由華中科技大學同濟醫(yī)學院免疫研究所沈關(guān)心教授惠贈。

靶細胞及效應(yīng)細胞的制備A549細胞用RPMI/1640培養(yǎng)液 (含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞制成懸液。NKTm細胞由中國人民解放軍總醫(yī)院腫瘤中心實驗室制備，具體培養(yǎng)方法參見本實驗室方法［6］。

pEGFR-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞將6孔板每孔加入1．5 ml培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中預熱至37℃;添加劑與核轉(zhuǎn)染溶液按1∶4．5的比例混合至100 μl;收集對數(shù)生長期的A549細胞1×106個，用上述100 μl混合液重懸細胞，充分混勻;加入2 μg pEGFR-EGFP質(zhì)粒;迅速將液體移入電轉(zhuǎn)杯中，蓋好杯蓋放入電轉(zhuǎn)儀中，選擇程序“A549 X-001”;按啟動鍵，將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至A549細胞后迅速將細胞混合液移入6孔板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育。

流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染率轉(zhuǎn)染后的A549細胞于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，棄上清，胰蛋白酶常規(guī)消化后用完全培養(yǎng)基中和，1 500 r/min，轉(zhuǎn)矩300 N·m，離心5 min后棄上清，PBS溶液重懸后清洗3遍，流式細胞儀檢測。

EGFR免疫組織化學檢測將轉(zhuǎn)染組及野生組A549細胞懸液分別滴到不同載玻片上，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)好的細胞玻片用PBS緩沖液漂洗2 min×3次。4%多聚甲醛室溫固定后滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加抗EGFR一抗，置于37℃烤箱孵育1 h后向細胞上滴加適量二抗工作液，置于保濕盒內(nèi)37℃烤箱孵育30 min。避光條件下二氨基聯(lián)苯胺顯色并蘇木素復染。顯微鏡下觀察染色及分化程度，最后乙醇脫水及封片。

細胞計數(shù)試劑盒-8法檢測A549細胞的抑制率將野生組A549細胞及轉(zhuǎn)染組A549細胞分別按50個/μl接種于96孔板，每孔中的液體量為100 μl。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育12 h;待其完全附壁后，加入西妥昔單抗 (終濃度0．05 g/L)，待藥物作用18 h后再加入1 250 個/μl的 NKTm 細胞100 μl(效靶比為25∶1)。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔加入細胞計數(shù)試劑盒-8試劑10 μl，2 h后用酶標儀 (測定波長450 nm)測定每孔光密度 (optical density，OD)值，最后結(jié)果取均值，以未處理組作為對照組，重復3次。

抑制率的計算西妥昔單抗對腫瘤細胞抑制率=1-(西妥昔單抗組OD值/靶細胞對照組OD值)×100%;聯(lián)合作用對腫瘤細胞抑制率=［靶細胞對照組OD值-(聯(lián)合作用組OD值-NKTm細胞對照組OD值)］ /靶細胞對照組OD值×100%;NKTm細胞對腫瘤細胞抑制率=［靶細胞對照組OD值-(NKTm細胞組OD值-NKTm細胞對照組OD值)］/靶細胞對照組OD值×100%。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 15．0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，組間差異采用秩和檢驗分析方法，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

轉(zhuǎn)染后EGFR蛋白表達情況應(yīng)用核轉(zhuǎn)染技術(shù)將pEGFR-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到A549細胞后，熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染后細胞呈現(xiàn)綠色熒光，流式細胞儀測得轉(zhuǎn)染率為22．3%。免疫組織化學結(jié)果顯示，野生組的A549細胞EGFR表達呈弱陽性 (1+)，轉(zhuǎn)染后的A549細胞EGFR表達呈強陽性 (3+)，且多為膜陽性(圖1)。

EGFR表達水平對ADCC作用的影響分別以野生組的A549細胞和轉(zhuǎn)染后高表達EGFR分子的A549細胞作為靶細胞，西妥昔單抗聯(lián)合NKTm細胞以及單獨西妥昔單抗、單獨NKTm細胞分別對靶細胞進行殺傷作用，結(jié)果顯示西妥昔單抗介導NKTm細胞對轉(zhuǎn)染后高表達EGFR的A549細胞的抑制率顯著高于野生組 (52．74 ±6．30 比 41．76 ±3．45，P ＜0．05)，而西妥昔單抗單藥及NKTm細胞單獨作用對EGFR表達水平不同的A549細胞的抑制率差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0．05)(表 1)。

圖1 EGFR免疫組織化學染色結(jié)果 (×20)Fig 1 Immunohistochemical staining for EGFR expression(×20)

表1 西妥昔單抗介導抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用對不同A549細胞的抑制率 (±s，%)Table 1 Inhibition rate of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activity mediated by cetuximab on different A549 cells(x－ ± s，%)

表1 西妥昔單抗介導抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用對不同A549細胞的抑制率 (±s，%)Table 1 Inhibition rate of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activity mediated by cetuximab on different A549 cells(x－ ± s，%)

與 A549細胞比較，aP＜0．05aP ＜0．05 compared with A549 cell

分組Group A549 pEGFR-EGFP-A549西妥昔單抗Cetuximab 16．11 ± 1．83 17．68 ±0．92 NKTm 細胞 NKTm cell 21．71 ±2．95 20．64 ±5．21西妥昔單抗+NKTm細胞Cetuximab+NKTm cell 41．76 ± 3．45 52．74 ±6．30a

討 論

一項Ⅲ期臨床研究結(jié)果表明西妥昔單抗聯(lián)合化療一線治療晚期非小細胞肺癌可以顯著延長患者的中位生存期 (11．3個月比10．1個月) 與1年生存率 (47%比42%)［3］。FLEX試驗是第1個證明EGFR抑制劑靶向藥物與化療聯(lián)用可以延長生存的臨床研究。然而，與結(jié)直腸癌治療中研究結(jié)果不同的是，西妥昔單抗在非小細胞肺癌的治療中缺乏有效的療效預測指標，研究表明K-ras基因突變、EGFR基因突變、EGFR基因擴增、與細胞骨架蛋白同源的第10號染色體缺失的磷酸酶基因表達情況均與西妥昔單抗治療非小細胞肺癌的療效無關(guān)［7-8］。直到第14屆世界肺癌大會，Pirker等［4］報道一項新的數(shù)據(jù)分析顯示，EGFR免疫組織化學評分為高表達組，聯(lián)合西妥昔單抗治療的有效率及生存期顯著高于單純化療，因此認為EGFR表達水平對西妥昔單抗聯(lián)合化療的生存期可能有預測作用，但尚缺乏前瞻性的研究加以證實。

西妥昔單抗除了可以與EGFR特異結(jié)合并阻斷下游信號的傳導外，還可以激活ADCC作用［1］，然而西妥昔單抗激活ADCC作用首先與腫瘤細胞表面EGFR結(jié)合，因此EGFR表達水平可能影響西妥昔單抗誘導的ADCC效應(yīng)從而影響其對非小細胞肺癌的療效。為了證實這個假設(shè)，本研究選擇A549細胞作為靶細胞，進行西妥昔單抗誘導ADCC作用殺傷非小細胞肺癌的體外研究。首先將A549細胞轉(zhuǎn)染EGFR基因，使轉(zhuǎn)染后的A549細胞高表達EGFR分子，之后檢測西妥昔單抗介導ADCC作用以及單獨西妥昔單抗對A549細胞轉(zhuǎn)染組與對照組的抑制率。研究中效應(yīng)細胞NKTm細胞是以CD3+、CD8+、CD56+和CD16+細胞為主要效應(yīng)細胞的混合淋巴細胞，已在臨床中廣泛用于過繼性細胞免疫治療［9］。本研究顯示西妥昔單抗介導的ADCC作用對高表達EGFR的A549細胞的抑制率顯著高于EGFR低表達組，差異具有統(tǒng)計學意義，而西妥昔單抗單獨作用于兩組的抑制率差異卻無統(tǒng)計學意義。因此，西妥昔單抗可能通過介導ADCC作用而對EGFR高表達的患者具有更好的療效。但Kurai等［1］認為肺癌細胞較低水平的EGFR表達已足夠產(chǎn)生西妥昔單抗介導的最大的ADCC活性，EGFR表達水平的進一步增加，對ADCC活性無相應(yīng)的影響。分析結(jié)果不同的原因可能為Kurai等［1］采用具有EGFR表達差異的不同肺癌細胞系作為靶細胞，而本研究采用的是具有EGFR表達差異的同一肺癌細胞系，這樣可避免因不同腫瘤細胞系間的其他潛在干擾因素而非EGFR蛋白表達水平對ADCC活性的影響。此外，效應(yīng)細胞的活性、效靶比的不同也影響著實驗結(jié)果，因此，尚需要進一步的研究以及臨床試驗進行驗證。

本研究結(jié)果提示西妥昔單抗介導的ADCC作用對EGFR蛋白高表達的肺腺癌A549細胞具有更強的殺傷作用，這提示可能正是因為西妥昔單抗介導的ADCC作用在非小細胞肺癌的治療中發(fā)揮重要作用，因此高表達EGFR的腫瘤患者在接受西妥昔單抗聯(lián)合化療治療后能夠獲得更好的療效。本研究從細胞水平證實了Pirker等［4］的研究結(jié)果。因此，在西妥昔單抗的臨床應(yīng)用中或許應(yīng)該增加對患者免疫狀態(tài)的關(guān)注，如果能夠提高患者的細胞免疫功能可能會達到更好的療效，此外患者的免疫狀態(tài)的相關(guān)指標是否可以作為西妥昔單抗療效預測因子也可以進一步探討。

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Role of Epidermal Growth Factor Receptor Expression Level in Cetuximab Cytotoxicity and Antibody-dependent Cell-mediated Cytotoxicity Effect Against A549 Lung Cancer Cell Line

LI Jin-yu，JIAO Shun-chang，ZHANG Guo-qing，SUN Sheng-jie

Department of Medical Oncology，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China

JIAO Shun-chang Tel：13811331264，E-mail：lijinyu301@sina．com

ObjectiveTo investigate the role of epidermal growth factor receptor(EGFR)expression level in cetuximab cytotoxicity and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity(ADCC)effect against A549 lung cancer cell line．MethodsA549 cell line and NKTm cells were used as the target cell and the effector cell，respectively．pEGFR-EGFP plasmids were transfected into A549 cells by nucleofector method．EGFR expression levels were measured by immunohistochemistry．The ADCC activity induced by cetuximab was assessed by cell counting kit-8 assay．ResultsA549 cells transfected with pEGFR-EGFP plasmids expressed higher level of EGFR protein on membrane and were more sensitive to ADCC activity mediated by cetuximab(P ＜0．05) ．The inhibition rate of A549 cells showed no significant difference between transfection group and wild-type group when treated with cetuximab alone(P＞ 0．05) ．Conclusion EGFR expression level influences the sensitivity of A549 lung cancer cell line to ADCC activity mediated by cetuximab but not to cetuximab alone．

book=47,ebook=53

cetuximab;non-small cell lung cancer;epidermal growth factor receptor

焦順昌 電話：13811331264，電子郵件：lijinyu301@sina．com

R735．5

A

1000-503X(2014)02-0164-04

10．3881/j．issn．1000-503X．2014．02．009

2013-06-17)

·論 著·