劉紅升，趙曉東，蘇 琴，王 瓊，姚詠明

中國人民解放軍總醫(yī)院 第一附屬醫(yī)院 1急救部 2超聲科，北京 100048

炎癥因子對類胰島素樣生長因子1沉默表達(dá)人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

劉紅升1，趙曉東1，蘇 琴1，王 瓊2，姚詠明1

中國人民解放軍總醫(yī)院 第一附屬醫(yī)院1急救部2超聲科，北京 100048

目的研究炎癥因子對類胰島素樣生長因子1(IGF1)沉默表達(dá)的人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞 (hCASMCs)增殖和凋亡的影響。方法應(yīng)用慢病毒RNA干擾技術(shù)沉默hCASMCs的IGF1表達(dá)。分別用未感染病毒載體的細(xì)胞和感染陰性對照病毒載體的hCASMCs作為空白對照和陰性對照。腫瘤壞死因子-α 50 ng/ml與白細(xì)胞介素-1β 40 ng/ml共同刺激細(xì)胞8 h。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IGF1濃度，MTT法及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的增殖及凋亡。結(jié)果炎癥因子刺激后，IGF1沉默表達(dá)的hCASMCs上清液中IGF1的濃度顯著低于空白對照組和陰性對照組 ［(426．35±120．96)比(1 030．69 ±54．69) 和 (992．82 ±26．90)pg/ml，P=0．000］; 細(xì)胞的增殖活性顯著低于兩個對照組 (0．302 ± 0．011 比0．401 ±0．028 和0．393 ±0．017，F(xiàn)=37．628，P=0．000)，凋亡率顯著高于對照組 ［(10．57 ±0．99)%比 (0．19 ±0．13)%和 (1．31±0．30)%，P=0．001］。結(jié)論炎癥因子可能具有抑制IGF1敲減后的hCASMCs增殖和促進(jìn)凋亡的作用。

類胰島素樣生長因子1;炎癥因子;人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞;RNA干擾;增殖;凋亡

Acta Acad Med Sin，2014，36(2)：176-179

類胰島素樣生長因子1(insulin-like grown factor 1，IGF1)具有調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖、定向遷移、分化和凋亡的作用。機(jī)體中IGF1可通過旁分泌或自分泌方式發(fā)揮生物學(xué)功能［1］。Okura等［2］認(rèn)為在動脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展期，巨噬細(xì)胞浸潤的內(nèi)膜的IGF1含量明顯少于斑塊的其他部位，表明IGF1水平低下伴巨噬細(xì)胞浸潤是晚期易損斑塊破裂的原因之一。本研究用IGF1慢病毒干擾載體轉(zhuǎn)染人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞 (human coronary artery smooth muscle cells，hCASMCs)，沉默hCASMCs的IGF1表達(dá)［3-4］，模擬易損斑塊血管平滑肌細(xì)胞自分泌IGF1減少的情況，用致炎癥前細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α) 和白細(xì)胞介素-1β (interleukin-1β，IL-1β) 共同刺激hCASMCs，探討炎癥因子對IGF1沉默表達(dá)的hCASMCs增殖及凋亡的影響。

材料和方法

hCASMCs培養(yǎng)及分組hCASMCs(Casecade生物制劑公司，俄勒岡州，美國)在加入培養(yǎng)液添加劑的231完全培養(yǎng)液 (Casecade生物制劑公司)中，于37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用第4代細(xì)胞實驗。我課題組采用慢病毒RNA干擾技術(shù)構(gòu)建了IGF1慢病毒表達(dá)載體，該載體能顯著敲減hCASMCs的IGF1基因表達(dá)，敲減效率大于70%［3］。

將hCASMCs分為3組：未感染病毒載體的細(xì)胞組(空白對照)，陰性對照病毒載體PSC-NC-pGCSIL-GFP感染的細(xì)胞組 (陰性對照)，IGF1慢病毒表達(dá)載體感染的細(xì)胞組;每組3個復(fù)孔。慢病毒載體系統(tǒng)購自上海吉凱公司。3組的病毒感染滴度分別為0、(1．5×107)、 (1．4 ×107)TU/ml。TNF-α 50 ng/ml與 IL-1β 40 ng/ml共同刺激各組細(xì)胞8 h后，研究炎癥因子刺激對各組細(xì)胞表達(dá)IGF1、細(xì)胞增殖和調(diào)亡的影響。

酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IGF1的表達(dá)IGF1為分泌型蛋白，采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液IGF1的濃度［3-4］。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒購自RayBiotech公司 (佐治亞州，美國)。

MTT法檢測細(xì)胞增殖收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，取細(xì)胞懸液200 μl以1×105/ml的密度接種于24孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。每孔加入0．01 mmol/L MTT(Sigma公司，加利福尼亞州，美國)20 μl，孵育4 h。棄上清，加入二甲基亞砜150 μl，室溫下振蕩5 min，Bio-Rad酶標(biāo)儀 (Beckman Coulter公司，加利福尼亞州，美國)測定570 nm處吸光值。

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡細(xì)胞經(jīng)冷PBS洗滌2次后，用-20℃預(yù)冷的70%乙醇4℃固定過夜。120×g離心4 min，棄上清，PBS洗滌3次，加100 μl PBS重懸，加40 μl含10 mg/ml Rnase的碘化丙啶染液 (Sigma公司)，4℃避光染色0．5 h，流式細(xì)胞儀 (BeckmanCoulter公司 加利福尼亞州，美國)測定熒光強(qiáng)度，采用CellQuest分析軟件進(jìn)行細(xì)胞周期DNA含量分析，確定細(xì)胞周期分布。流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長為488 nm，每次計數(shù)5 000個細(xì)胞。

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 10．0統(tǒng)計軟件。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)的比較采用Student’s t檢驗，3組間均數(shù)差異的比較采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計的方差分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

炎癥因子降低IGF1沉默表達(dá)的hCASMCs表達(dá)IGF1酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果顯示，未用炎癥因子刺激的空白對照組、陰性對照組和IGF1慢病毒表達(dá)載體感染的細(xì)胞組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IGF1的濃度分別為(1 137．99 ± 44．17)、(1 096．30 ± 94．20) 和 (753．30 ±152．06)pg/ml，IGF1慢病毒表達(dá)載體感染細(xì)胞組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IGF1的濃度顯著低于另外兩組 (P=0．008)。炎癥因子刺激的3組細(xì)胞上清液中IGF1的濃度分別為 (1 030．69 ±54．69)、 (992．82 ±26．90) 和(426．35 ±120．96)pg/ml，IGF1 慢病毒表達(dá)載體感染細(xì)胞組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IGF1的濃度顯著低于另外兩組 (P=0．000)。炎癥因子刺激后兩個對照組細(xì)胞上清液中IGF1的濃度較炎癥因子刺激前有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0．05);而IGF1慢病毒表達(dá)載體感染細(xì)胞的上清液中IGF1的濃度較炎癥因子刺激前顯著降低 (P=0．001)。

炎癥因子抑制IGF1沉默表達(dá)的hCASMCs增殖析因設(shè)計的方差分析顯示，對未經(jīng)炎癥因子刺激的hCASMCs，干擾 RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活力為 0．341±0．020，顯著低于空白對照組 (0．417 ±0．035) 和陰性對照組 (0．401 ±0．019)(F=12．077，P=0．001);兩個對照組的細(xì)胞活力相近。炎癥因子刺激后，干擾RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活力為0．302±0．011，顯著低于空白對照組 (0．401 ±0．028) 和陰性對照組 (0．393 ±0．017)(F=37．628，P=0．000); 兩個對照組的細(xì)胞活力相近。兩個對照組炎癥因子刺激均未顯著降低細(xì)胞的活力 (P＞0．05)。在炎癥因子刺激下，IGF1慢病毒表達(dá)載體感染細(xì)胞的活力顯著降低 (P=0．000)。

炎癥因子促進(jìn)IGF1沉默表達(dá)的hCASMCs凋亡不論經(jīng)炎癥因子刺激與否，IGF1沉默表達(dá)的hCASMCs的凋亡率均顯著高于兩個對照組 (P=0．000)。兩個對照組炎癥因子刺激均未顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡 (P＞0．05)。在炎癥因子刺激下，IGF1沉默表達(dá)的hCASMCs的凋亡率顯著增加 (P=0．001)(表1)。

討 論

目前，尚不能確定IGF1是抑制急性冠脈綜合征斑塊形成的保護(hù)因子，還是斑塊進(jìn)展的促進(jìn)因子［5-7］。本研究在沉默hCASMCs中IGF1表達(dá)的基礎(chǔ)上，模擬易損斑塊血管平滑肌IGF1表達(dá)減少的情況，用致炎癥前細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β共同刺激hCASMCs，探討炎癥因子對IGF1沉默表達(dá)的hCASMCs增殖及凋亡的影響。研究表明血管平滑肌細(xì)胞中存在抗凋亡機(jī)制，TNF-α單獨刺激不能使血管平滑肌細(xì)胞凋亡［8-9］，在易損斑塊中血管平滑肌細(xì)胞同時受到兩種以上的致炎癥前細(xì)胞因子刺激，因此本研究選取TNF-α和IL-1β共同刺激hCASMCs。結(jié)果顯示TNF-α+IL-1β對空白對照組hCASMCs上清液中IGF1的濃度有下調(diào)作用，但與非炎癥因子處理組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。由于酶聯(lián)免疫吸附試驗方法測定的是細(xì)胞培養(yǎng)上清中IGF1的濃度，而不僅是hCASMCs IGF1的表達(dá)量;此外，IGF1慢病毒表達(dá)載體感染細(xì)胞的上清液中IGF1的濃度較炎癥因子刺激前顯著降低，由此筆者推測當(dāng)hCASMCs自分泌或旁分泌IGF1減少時，TNF-α+IL-1β能進(jìn)一步下調(diào)hCASMCs表達(dá)IGF1，具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

當(dāng)TNF-α+IL-1β刺激hCASMCs時，IGF1慢病毒表達(dá)載體感染細(xì)胞的增殖活力顯著低于兩個對照組，凋亡率顯著高于其他兩組;表明在IGF1自分泌或旁分泌減少時，炎癥因子促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用被減弱，此外，局部的炎性刺激將促進(jìn)hCASMCs凋亡。Shai等［10］研究顯示過度表達(dá) IGF1基因能提高ApoE基因-/-小鼠粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。這可能是易損斑塊內(nèi)炎癥細(xì)胞釋放的致炎癥因子對斑塊內(nèi)血管平滑肌細(xì)胞損害加重的原因之一。這一結(jié)尚需進(jìn)一步證實。

表1 各組hCASMCs的細(xì)胞周期與凋亡的比較 (n=3，±s，%)Table 1 Comparison of cell cycle and apoptosis in hCASMCs in different groups(n=3，x－±s，%)

表1 各組hCASMCs的細(xì)胞周期與凋亡的比較 (n=3，±s，%)Table 1 Comparison of cell cycle and apoptosis in hCASMCs in different groups(n=3，x－±s，%)

hCASMCs：人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞;Con：空白對照組;NC：陰性對照組;RNAi：類胰島素樣生長因子1慢病毒表達(dá)載體感染細(xì)胞組;CV：變異系數(shù); 與 RNAi組比較，aP＜0．01; 與未刺激組比較，bP＜0．01hCASMCs：human coronary artery smooth muscle cells;Con：blank control;NC：negative control;RNAi：hCASMCs transfected with lentiviral vector carrying insulin-like grown factor gene 1;CV：coefficient of variance;aP ＜ 0．01 compared with RNAi group;bP ＜ 0．01 compared with insulin-like grown factor gene 1-slienced hCASMCs without simulation of inflammatory factors

Cell cycle 凋亡分組Group 細(xì)胞周期Apoptosis Con 未刺激 Without simulation 42．27 ±1．21 23．21 ±1．08 34．84 ±0．72 9．20 ±0．52 0．09 ±0．02a刺激 Simulation with inflammatory factors 46．86 ±0．47 23．31 ±1．55 28．17 ±4．20 10．68 ±0．56 0．19 ±0．13 G0+G1 G2+M S CV a NC 未刺激 Without simulation 44．92 ±0．90 28．78 ±0．96 25．81 ±0．35 9．67 ±0．98 0．18 ±0．07a刺激 Simulation with inflammatory factors 39．49 ±0．87 33．36 ±1．52 26．81 ±0．96 9．32 ±2．04 1．31 ±0．30a RNAi 未刺激 Without simulation 41．49 ±0．61 21．96 ±0．62 28．97 ±2．55 11．92 ±0．38 7．66 ±0．89刺激 Simulation with inflammatory factors 38．79 ±1．01 23．89 ±1．55 27．68 ±3．60 12．37 ±0．45 10．57 ±0．99b

綜上，炎癥因子可能具有抑制IGF1敲減后的hCASMCs增殖和促進(jìn)凋亡的作用。

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Effect of Inflammatory Factors on Cell Proliferation and Apoptosis in Insulin-like Grown Factor 1-slienced Human Coronary Artery Smooth Muscle Cells

LIU Hong-sheng1，ZHAO Xiao-dong1，SU Qin1，WANG Qiong2，YAO Yong-ming1

1Deparment of Emergency，2Deparment of Ultrasound，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital，Beijing 100048，China

ZHAO Xiao-dong Tel：010-66867371，E-mail：zxd63715@126．com

ObjectiveTo study the effect of inflammatory factors on cell proliferation and apoptosis in insulin-like grown factor 1(IGF1)-slienced human coronary artery smooth muscle cells(hCASMCs)．MethodsWe silenced the expression of IGF1 in hCASMCs using the lentivirus-mediated RNA interference technology．Blank control group and negative control group were set using the hCASMCs without the infection of a virus vector and the hCASMCs with the infection of a negative control virus vector，respectively．After the treatment of these cells with both tumor necrosis factor-α 50 ng/ml and interleukin-1β 40 ng/ml，the concentration of IGF1 in cell-culture medium was detected by enzyme-linked immunosorbent assay，and the proliferation and apoptosis were evaluated by MTT assay and flow cytometry．ResultsAfter the simulation with inflammatory factors，the concentration of IGF1 in the supernatant fluid of cultured IGF1-slienced hCASMCs was significantly lower than those in the blank control group and negative control group ［(426．35 ±120．96)vs．(1 030．69 ±54．69)and(992．82 ± 26．90)pg/ml，P=0．000) ．The proliferation of IGF1-slienced hCASMCs was substantially much less than the two control groups(0．302 ± 0．011 vs．0．401 ± 0．028 and 0．302 ± 0．011，F(xiàn)=37．628，P=0．000)，and the apoptosis rate of IGF1-slienced hCASMCs was significant increased compared with the other two groups ［(10．57 ±0．99)%vs．(0．19 ±0．13)%and(1．31 ±0．30)% ，P=0．001］ ．Conclusion Inflammatory factors can inhibit the cell proliferation and promote apoptosis after the knock-down of IGF1 in hCASMCs．

insulin-like grown factor 1;inflammation factors;human coronary artery smooth muscle cells;RNA interference;proliferation;apoptosis

趙曉東 電話：010-66867371，電子郵件：zxd63715@126．com

R392．12

A

1000-503X(2014)02-0176-04

10．3881/j．issn．1000-503X．2014．02．011

國家杰出青年科學(xué)基金 (30125020)Supported by the National Sciences Foundation for Outstanding Youth of China(30125020)

2013-09-26)

·論 著·