倪 郁，宋 超，王小清

(西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400716)

植物表皮蠟質(zhì)是指覆蓋在植物表皮細(xì)胞外的一層由親脂性化合物構(gòu)成的疏水層，一般呈綠灰色、灰白色霜狀[1]。作為植物與環(huán)境的第一接觸面，具有特殊微晶體形態(tài)以及復(fù)雜化學(xué)組分的表皮蠟質(zhì)可有效地協(xié)調(diào)植物與環(huán)境的關(guān)系。前人研究表明，植物蠟質(zhì)具有很好的生態(tài)學(xué)功能[2-4]，例如，阻止植物組織的非氣孔性水分散失、防止植物被有害光線損傷、保護(hù)植物避免某些昆蟲(chóng)的蠶食等功能。蠟質(zhì)的物理和化學(xué)屬性是其生態(tài)學(xué)功能得以實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)。在面對(duì)病原菌等生物環(huán)境因子脅迫時(shí)，一些植物葉片及水果表皮蠟質(zhì)層的厚度和三維晶體結(jié)構(gòu)可有效抵御真菌病原物的入侵[5-6]。植物表皮蠟質(zhì)的含量及化學(xué)組成與植株抗病性的強(qiáng)弱密切相關(guān)[7-11]，表皮蠟質(zhì)也因此被認(rèn)為是抵御病原物的第一道屏障[12]。葉表面特性影響葉片潤(rùn)濕性、孢子萌發(fā)管方向及病菌從氣孔侵入[13]。大麥(Hordeumvulgare)葉表皮蠟質(zhì)誘導(dǎo)了布氏白粉菌(Blumeriagraminis)附著胞的分化，而非寄主植物葉蠟的誘導(dǎo)效果則很小；大麥葉蠟組分C26醛是誘導(dǎo)布氏白粉菌(Blumeriagraminis)附著胞分化的主要因子[14]。智利大麥(Hordeumchilense)、東部白松(Pinusstrobus)等葉片氣孔被角質(zhì)層蠟質(zhì)覆蓋后，阻止了病原菌從氣孔侵入[13,15]。玫瑰抗黑斑病的強(qiáng)弱與葉表皮蠟質(zhì)中的烷和脂類物質(zhì)有關(guān)[9]；擬南芥蠟質(zhì)突變體sma4/lacs2由于角質(zhì)層膜透性的改變使得植株體內(nèi)抗真菌物質(zhì)可以更快地釋放到植物表面而表現(xiàn)出對(duì)灰霉菌(Botrytiscinerea)的抗性增強(qiáng)[16]。這些研究通過(guò)對(duì)植物蠟質(zhì)特性的分析不同程度地解釋了表皮蠟質(zhì)影響真菌侵染的作用機(jī)制，但真菌病原物侵染對(duì)植物表皮蠟質(zhì)物理結(jié)構(gòu)及化學(xué)組成的影響還不清楚。近年來(lái)，隨著植物化學(xué)、分子遺傳學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展和滲透，植物蠟質(zhì)的研究也得到進(jìn)一步深入，其生態(tài)學(xué)功能也得到重新評(píng)估。擬南芥作為研究遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的一種模式植物，具有典型的角質(zhì)層結(jié)構(gòu)及組分。其角質(zhì)層結(jié)構(gòu)主要由3層組成：最外層的蠟質(zhì)層(EW)、真角質(zhì)層(CP)和角化層(CL)[3]。蠟質(zhì)主要由可溶性的超長(zhǎng)鏈脂肪酸、烷烴、一級(jí)醇、二級(jí)醇、脂肪醛、酮類、酯類等組成，并具有特定的晶體形態(tài)。因此擬南芥也常被用作角質(zhì)層蠟質(zhì)研究的模式材料。

核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)是世界上破壞性最強(qiáng)的植物病原物之一，引起的菌核病是導(dǎo)致許多作物減產(chǎn)的主要病害。實(shí)驗(yàn)室前期研究工作發(fā)現(xiàn)S.sclerotiorum侵染甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)后，抗性品種表皮蠟質(zhì)中的烷類、醛類顯著增加[17]。為了揭示病原物侵染對(duì)植物表皮蠟質(zhì)的影響機(jī)制以及如何突破表皮蠟質(zhì)這一屏障，本試驗(yàn)以擬南芥野生型以及蠟質(zhì)缺失突變體cer1、cer4為試驗(yàn)材料，從蠟質(zhì)的晶體形態(tài)以及化學(xué)組分的變化來(lái)分析植物蠟質(zhì)在S.sclerotiorum脅迫下的表現(xiàn)，以期進(jìn)一步闡明植物表皮蠟質(zhì)與病原物的互作機(jī)制，為生產(chǎn)實(shí)踐中通過(guò)改變植物表面特征而改良植物抗病性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

哥倫比亞野生型(Col-0) 擬南芥種子為西南大學(xué)植物生理生化研究室保存，表皮蠟質(zhì)突變體cer1(蠟質(zhì)中烷、次級(jí)醇、酮含量減少)、cer4(蠟質(zhì)中一級(jí)醇含量減少)種子均購(gòu)于擬南芥資源中心(ABRC，USA)。將蛭石、珍珠巖和有機(jī)土按1∶1∶1的比例混勻后裝入花盆(直徑7 cm×高度8 cm)，將低溫春化后的種子播在花盆中，每盆4 株，然后用塑料薄膜覆蓋5 d以利于出苗。試驗(yàn)材料放置在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為125 mmol m-2s-1，溫度為21 ℃/23 ℃(黑夜/白天)，光照每天16 h，空氣濕度為75%。待植株生長(zhǎng)至5—6 周時(shí)進(jìn)行核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)接種，以不接種為對(duì)照。

1.2 核盤菌培養(yǎng)及接種方法

核盤菌菌核分離自油菜病株，經(jīng)表面消毒后在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上培養(yǎng)。病菌培養(yǎng)參考臧憲朋等[18]方法，先活化核盤菌菌，即從核盤菌平板菌落外緣用滅菌的打孔器切取直徑為6 mm的菌絲塊，移至新PDA培養(yǎng)基平板中央，在25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)活化培養(yǎng)2 d，然后以同樣方法再次轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上培養(yǎng)，3 d后從菌落邊緣新生的菌絲中用滅菌的打孔器取直徑為6 mm的菌絲塊，按10 塊/100 mL加入到PDA液體培養(yǎng)基中，在25 ℃、150—200 r/min下振蕩培養(yǎng)4—6 d，待培養(yǎng)基中充滿細(xì)小菌絲時(shí)，用組織勻漿機(jī)粉碎，制成菌絲懸浮液并將濃度調(diào)至OD600值為1.0，進(jìn)行噴霧接種。接種后調(diào)節(jié)空氣濕度大于90%培養(yǎng)擬南芥植株，接種72 h后取樣進(jìn)行蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)及組分分析。以噴施不含核盤菌的PDA液體培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.3 表皮蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察

在預(yù)試驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[1]中，擬南芥葉片在電鏡觀察下無(wú)明顯蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，且蠟質(zhì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于莖稈，因此本試驗(yàn)所用材料除特殊說(shuō)明外均為擬南芥莖稈。分別取對(duì)照與接種處理的擬南芥植株，將其干燥后剪取中部1 cm長(zhǎng)莖段，貼于電鏡載物臺(tái)上，進(jìn)行離子濺射鍍金后在掃描電鏡(S3000-N，Hitachi)下觀察、拍照。每處理3 個(gè)重復(fù)。

1.4 表皮蠟質(zhì)的提取

分別從對(duì)照與接種處理材料蓮座葉根部剪下擬南芥莖桿，去莖生葉及種莢。將整株莖稈放入含有10 mL氯仿的試管中浸提30 s，以提取表面蠟質(zhì)，氯仿中加入C16烷作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。氮吹儀吹干浸提液，在100 ℃下用80 μL BSTFA衍生20 min，再經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?，溶?00 μL正己烷中，進(jìn)行色譜-質(zhì)譜分析。每3 株莖稈為一個(gè)重復(fù)用于提取表面蠟質(zhì)，每處理3 個(gè)重復(fù)。

1.5 表皮蠟質(zhì)組分及含量的GC-MS分析

擬南芥表皮蠟質(zhì)組成及含量利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GCMS-QP2010 plus)進(jìn)行分析測(cè)定。程序升溫方式：初溫80 ℃，保持2 min；每分鐘15 ℃升溫至260 ℃，保持10 min。然后每分鐘10 ℃升溫至320 ℃，保持5 min?；贔ID峰值量化蠟質(zhì)，根據(jù)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物(C16烷)的濃度計(jì)算各蠟質(zhì)組分含量。蠟質(zhì)含量用單位面積上的微克數(shù)(μg/cm2)進(jìn)行表示。莖桿面積測(cè)定采用數(shù)字化掃描儀(EPSON V750)和WinFOLIA專業(yè)葉片圖像分析系統(tǒng)(Regent Instrument Inc, Canada)進(jìn)行分析并記錄。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS13.0軟件分析接種核盤菌對(duì)擬南芥莖表皮蠟質(zhì)組分含量的影響。顯著水平為P<0.05(LSD檢驗(yàn))。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥對(duì)核盤菌的感病性

將核盤菌噴霧接種24 h后，擬南芥野生型及各突變體材料葉片、莖稈不同程度地變褐，其中cer4突變體發(fā)病較輕。噴霧接種72 h后，所試材料均整株發(fā)病而呈現(xiàn)枯黃。

2.2 核盤菌脅迫下擬南芥蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的變化

擬南芥莖稈表面分布有不同類型的蠟質(zhì)晶體。掃描電鏡顯示，野生型(WT)擬南芥蠟質(zhì)晶體分布密度高，晶體類型以垂直于表面的桿狀、塊狀結(jié)構(gòu)為主(圖1a,b)。接種核盤菌后，野生型擬南芥桿狀蠟質(zhì)晶體顯著減少，蠟質(zhì)晶體呈現(xiàn)出似融入表皮的趨勢(shì)，晶體邊界模糊，表皮凹凸不平，呈“囊狀凸起”；部分區(qū)域表皮呈“撕裂” 狀(圖1c—f)。表皮蠟質(zhì)突變體cer1與野生型相比，蠟質(zhì)晶體分布密度顯著減少，體積變小，晶體類型以水平的松針狀、塊狀結(jié)構(gòu)為主(圖2a,b)。接種處理后，突變體cer1莖稈表面可觀察到縱橫交錯(cuò)的菌絲(圖2c)，松針狀結(jié)構(gòu)顯著減少或消失，其余蠟質(zhì)晶體邊緣變得模糊，晶體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出與野生型接種處理后相似的變化，部分區(qū)域表皮呈“囊狀凸起”或“撕裂” 狀(圖2d—f)。突變體cer4蠟質(zhì)晶體表現(xiàn)出與野生型完全不同的結(jié)構(gòu)，晶體類型以垂直片層結(jié)構(gòu)為主(圖3a,b)。接種處理后，突變體cer4晶體分布密度減少，部分區(qū)域垂直片層結(jié)構(gòu)消失，表皮凹凸不平，呈“囊狀凸起”(圖3c—e)。

2.3 核盤菌脅迫下擬南芥表皮蠟質(zhì)組分的變化

本試驗(yàn)中，擬南芥被檢測(cè)到的表皮蠟質(zhì)組分主要有一級(jí)醇類、醛類、酸類、烷類、次級(jí)醇類及酮類，其中烷類在蠟質(zhì)總量中所占的比重最高(34%—58%)。與野生型相比，cer1突變體表皮蠟質(zhì)中醛、烷、次級(jí)醇和酮含量以及蠟質(zhì)總量均顯著減少；cer4突變體表皮蠟質(zhì)中一級(jí)醇水平顯著下降。接種核盤菌后，野生型擬南芥與蠟質(zhì)突變體cer1、cer4一級(jí)醇含量分別增加了152%、54%和883%，其中野生型與突變體cer4一級(jí)醇類增加顯著。各材料蠟質(zhì)組分中烷類、次級(jí)醇類、酮類含量與蠟質(zhì)總量在接種核盤菌后均顯著減少，烷類分別減少了35%(WT)、48%(cer1)、33%(cer4)。接種核盤菌后，酸類減少(cer1、WT)或無(wú)顯著變化(cer4)；醛類含量變化在各材料中不一致(圖4)。

圖1 核盤菌脅迫下野生型(WT)擬南芥莖表皮蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的變化

圖2 核盤菌脅迫下擬南芥cer1突變體莖表皮蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的變化

圖3 核盤菌脅迫下擬南芥cer4突變體莖表皮蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的變化

圖4 接種核盤菌對(duì)擬南芥表皮蠟質(zhì)組分含量及蠟質(zhì)總量的影響

3 討論

前人研究表明，蠟質(zhì)具有特殊的微晶體形態(tài)以及復(fù)雜的化學(xué)組分，這是其生態(tài)學(xué)功能得以實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)，也為植物適應(yīng)不同生境提供了保證[19]。外界非生物因素能夠影響植物表皮蠟質(zhì)。柑桔在乙烯的誘導(dǎo)下表皮蠟質(zhì)含量增加，蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[20]。紫花苜蓿葉表蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)在低空氣濕度和水分脅迫下發(fā)生了不同程度的熔融變化[21]。擬南芥莖稈表面分布有不同類型的蠟質(zhì)晶體，例如，野生型擬南芥垂直于表面的桿狀、塊狀晶體結(jié)構(gòu)，突變體cer1的水平松針狀、塊狀結(jié)構(gòu)，突變體cer4的垂直片狀結(jié)構(gòu)。本研究表明生物因素也會(huì)影響植物表皮蠟質(zhì)的特性。在核盤菌脅迫下，野生型擬南芥與蠟質(zhì)突變體cer1分別表現(xiàn)出桿狀、松針狀蠟質(zhì)晶體顯著減少；野生型與突變體cer1、cer4部分區(qū)域蠟質(zhì)晶體均表現(xiàn)出熔入表皮趨勢(shì)，表皮凹凸不平而呈現(xiàn)出“囊狀凸起”現(xiàn)象，其中野生型與突變體cer1表皮膜層在這些“囊狀凸起”的某些區(qū)域呈“撕裂”狀。綜合擬南芥野生型與突變體的這些蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，暗示了蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)在病菌脅迫下的變化模式可能為：桿狀等晶體減少，蠟質(zhì)晶體熔融，表皮膜層“囊狀凸起”，最終表皮膜層破裂。核盤菌在附著胞形成后依靠巨大膨壓機(jī)械地穿透角質(zhì)層及表皮細(xì)胞壁，而病菌一旦突破角質(zhì)層及表皮細(xì)胞后，很快以分枝生長(zhǎng)，遍布表皮及葉肉細(xì)胞[22]。核盤菌脅迫下擬南芥表皮蠟質(zhì)晶體的減少以及表皮膜層的破裂將更有利于病菌侵入到植株體內(nèi)。

有研究報(bào)道，擬南芥抗病基因PR1的表達(dá)與葉表皮蠟質(zhì)層中部分蠟質(zhì)組分密切相關(guān)[23]。紫花苜蓿(Medicagotruncatula)抗銹菌突變體irg1與野生型相比，其葉片下表皮蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)缺失，疏水性減少，蠟質(zhì)組分中C30一級(jí)醇減少了90%以上，而C29、C31烷則顯著增加[24]。白粉菌(Erysiphe.pisi)在豌豆(Psiumsativum)葉片近軸端的出芽率高于遠(yuǎn)軸端，蠟質(zhì)組分分析結(jié)果表明，其葉片近軸端蠟質(zhì)組分一級(jí)醇含量較高，而遠(yuǎn)軸端組分以烷類為主[25]。本試驗(yàn)中，野生型擬南芥中一級(jí)醇含量(0.582 μg/cm2)占自身蠟質(zhì)總量的2.057%，突變體cer1和cer4一級(jí)醇含量(0.399，0.096 ug/cm2)分別占其自身蠟質(zhì)總量的13.3%和0.51%。一級(jí)醇含量最低的cer4突變體在核盤菌脅迫下除部分區(qū)域表皮“囊狀”凸起外，晶體類型無(wú)顯著變化，也無(wú)表皮破裂現(xiàn)象。這部分地解釋了突變體cer4在接種早期相對(duì)較慢的發(fā)病進(jìn)程。cer1突變體以及野生型擬南芥較高的一級(jí)醇含量可能與其受到核盤菌脅迫后表皮膜層的破裂有關(guān)。擬南芥各材料中烷類、次級(jí)醇類、酮類含量與蠟質(zhì)總量在接種核盤菌后均顯著減少，這與掃描電鏡觀察到的蠟質(zhì)晶體在受到病菌脅迫后減少的趨勢(shì)相符合。蠟質(zhì)組分的變化說(shuō)明核盤菌侵染對(duì)表皮蠟質(zhì)的影響不僅僅是對(duì)結(jié)構(gòu)的物理作用，同時(shí)在蠟質(zhì)代謝層面也受到影響。而野生型擬南芥與蠟質(zhì)突變體在接種后一級(jí)醇類含量的普遍增加是否與核盤菌侵染有關(guān)、以及蠟質(zhì)化學(xué)組分的變化與晶體結(jié)構(gòu)的相應(yīng)關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

在包括擬南芥在內(nèi)的大多數(shù)植物中, 角質(zhì)層蠟質(zhì)生物合成主要通過(guò)脫羰基途徑與酰基還原途徑進(jìn)行。在擬南芥中, 醛、次級(jí)醇、烷、酮等約80%的蠟質(zhì)組分通過(guò)脫羰基途徑產(chǎn)生，而一級(jí)醇、酯類等約20%的蠟質(zhì)組分由酰基還原途徑產(chǎn)生[26]。本研究中，擬南芥在受到病害脅迫后烷類、次級(jí)醇、酮類含量的減少以及一級(jí)醇含量的普遍增加暗示了蠟質(zhì)前體物質(zhì)在受到病害脅迫后更多地通過(guò)?；€原途徑生成一級(jí)醇，從而減少了由脫羰基途徑所生成的蠟質(zhì)組分。由于烷類物質(zhì)在擬南芥蠟質(zhì)總量中所占的比重最高(34%—58%)，因此即使一級(jí)醇含量增加，蠟質(zhì)總量也因?yàn)橥轭惖臏p少而呈減少趨勢(shì)。研究結(jié)果顯示，生物逆境下擬南芥植株蠟質(zhì)化學(xué)組分的變化可能是由于不利環(huán)境因子的作用改變了蠟質(zhì)合成途徑，從而影響了蠟質(zhì)組分的分泌量。

4 結(jié)論

核盤菌侵染能改變植物表皮蠟質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)及化學(xué)組分的分泌量，并以此來(lái)促進(jìn)對(duì)表皮層的侵入。

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