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      染色、透明時(shí)間影響姜片吸蟲標(biāo)本制作效果研究

      2014-10-10 07:11:24吳家斌余細(xì)蓮
      江西畜牧獸醫(yī)雜志 2014年4期
      關(guān)鍵詞:姜片染液吸蟲

      吳家斌,余細(xì)蓮

      (江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江西 南昌 330045)

      姜片吸蟲病是布氏姜片吸蟲寄生于人和豬的小腸內(nèi)引起的一種人畜共患病,嚴(yán)重危害著兒童健康及仔豬生長(zhǎng)發(fā)育[1、2]。為減少經(jīng)濟(jì)損失,從教學(xué)科研入手探尋姜片吸蟲病診斷、防治的新方法,標(biāo)本制作在寄生蟲病的教學(xué)科研中發(fā)揮著十分重要作用[3]。寄生蟲標(biāo)本特別是蠕蟲標(biāo)本制作,常因采集活蟲體標(biāo)本的時(shí)間、數(shù)量等條件因素的限制,不能及時(shí)全部進(jìn)行染色制片,采用不同固定液保存后,待需要時(shí)進(jìn)行染色制片。吸蟲類染色標(biāo)本制作過程包括固定、染色、脫水、透明和封片等5個(gè)步驟。但具體到不同蟲種,實(shí)際操作步驟亦有所不同。本試驗(yàn)以福爾馬林固定20多年的姜片吸蟲和德氏蘇木素染液,蟲體較大而肥厚,染色標(biāo)本制作難度較大。目前,未見有關(guān)姜片吸蟲染色片制作的報(bào)道。本研究旨以長(zhǎng)期固定的較大肥厚蟲體,制作永久性染色標(biāo)本提供理論依據(jù)。

      1 材料

      1.1 蟲體

      福爾馬林固定20多年的姜片吸蟲(江西農(nóng)大動(dòng)科院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室提供)。

      1.2 染料及藥品

      蘇木素、無(wú)水酒精、二甲苯、36%鹽酸、濃氨水、甘油、銨明礬、中性樹膠。

      1.3 器具

      解剖鏡、數(shù)碼相機(jī)、托盤天平、玻片鑷、1.5mm厚載玻片、3mm厚載玻片(自制)、蓋玻片(自制)擦鏡紙、定性濾紙(直徑12cm)、燒杯(500mL、250mL)、刻度吸管(10mL),洗耳球(中號(hào))量筒(100mL)、扁形稱量瓶(50mL)、玻璃漏斗(直徑12cm)、鐵三角架、棕色試劑瓶(250mL)、文件夾子(中號(hào))、滴管(膠頭)。

      2 方法

      2.1 溶液的制備

      2.1.1 脫水液。洗耳球及刻度吸管分別吸取無(wú)水酒精6mL、10mL、16mL、18mL、19mL、20mL于扁形稱量瓶中,又分別吸取蒸餾水14mL、10mL、4mL、2mL、1mL、0mL依次兌加,配制30%、50%、80%、90%、95%、100%酒精溶液標(biāo)記備用。

      2.1.2 染色液。天平稱取蘇木素2g,倒入含有12.5mL 95%酒精的500mL燒杯中,向其中加入200mL的飽和銨明礬溶液(約含銨明礬11%),將此混合液曝露于日光及空氣中3~7d或更長(zhǎng)時(shí)間,待其充分氧化成熟,再分別加入甘油、甲醇各50mL保存,并待其顏色充分變暗,經(jīng)定性濾紙置鐵三角架上的玻璃漏斗中過濾,濾液用燒杯接裝后倒入棕色試劑瓶中標(biāo)記備用。

      2.1.3 退色液。洗耳球及刻度吸管分別吸取無(wú)水酒精、蒸餾水、鹽酸各35mL、15mL、1mL于250mL燒杯中混勻,倒出約20mL于扁形稱量瓶中標(biāo)記備用。

      2.1.4 透明液。倒出約20mL二甲苯于扁形稱量瓶中標(biāo)記備用。

      2.2 蟲體固定液的脫去

      玻片鑷取出福爾馬林固定多年的姜片吸蟲于燒杯中,加滿清水浸泡24h后分別移入70%、50%、30%酒精浸泡各1h。

      2.3 蟲體制薄

      玻片鑷取出已脫去固定液的1條蟲體于兩塊自制載玻片之間,以文件夾子夾住,使蟲體受力逐漸增大、均勻,整體浸泡水中24h或更長(zhǎng)時(shí)間,觀察蟲體相當(dāng)薄時(shí)可卸掉文件夾子取下蟲體進(jìn)行染色制片。

      2.4 試驗(yàn)分組

      蟲體染色、透明時(shí)間,綜合參考唐愛芬、肖芳萍、徐會(huì)梅、孔繁瑤[4~7]對(duì)吸蟲標(biāo)本制作方法改進(jìn)設(shè)定。試驗(yàn)共分9組,每組3個(gè)蟲體重復(fù)。染色時(shí)間設(shè)為16h、22h、28h,每個(gè)染色時(shí)間又分16h、22h、28h不同透明時(shí)間。

      2.5 染色標(biāo)本制作[4]

      洗耳球、刻度吸管吸取染色液2mL于扁形稱量瓶中,兌加20mL蒸餾水將染色液稀釋10倍;蟲體置染色液中分別經(jīng)16h、22h、28h取出,蒸餾水沖洗后分別通過30%、50%、70%酒精依次經(jīng)35min、40min、45min脫水;移入退色液(酸酒精)中,退色時(shí)間以觀察蟲體表面呈淡紅色,內(nèi)部構(gòu)造呈深紅色,顏色深淺分明為好;蟲體分別移入80%、90%、95%、100%依次經(jīng)40min、30min、50min、60min后再移入二甲苯中透明,透明時(shí)間分別為16h、22h、28h;取出蟲體置載玻片上,滴加適量中性樹膠,加蓋自制蓋玻片封固。

      2.6 標(biāo)本效果評(píng)定

      解剖鏡下觀察姜片吸蟲形態(tài)結(jié)構(gòu),每個(gè)蟲體按口吸盤、腹吸盤、盲腸、卵黃腺、梅氏腺、卵巢、子宮及睪丸8個(gè)器官結(jié)構(gòu)清晰度給分,清晰的給2分,隱約可見的給1分,不見的給0分,每組3個(gè)蟲體重復(fù),每組蟲體總得分為48分(2×8×3=48),以每組蟲體器官結(jié)構(gòu)的清晰度為效果評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)(清晰度=實(shí)得分/總得分×100%)。

      3 結(jié)果

      3.1 染色、透明時(shí)間對(duì)各組蟲體器官結(jié)構(gòu)清晰度影響情況

      染色16h、22h、28h中的透明22h的清晰度分別以89.6%、83.3%和75%為最高,其中又以染色16h、透明22h時(shí)清晰度89.6%為最高,標(biāo)本效果最好;3個(gè)染色時(shí)間內(nèi)的3個(gè)透明時(shí)間姜片吸蟲的8種器官結(jié)構(gòu)以卵黃腺清晰度均為100%為最高易著色,卵巢、盲腸清晰度最低(詳見表1和圖1)。

      表1 染色、透明時(shí)間對(duì)各組蟲體器官結(jié)構(gòu)清晰度影響情況

      圖1 染色、透明時(shí)間對(duì)各組蟲體標(biāo)本清晰度影響情況

      3.2 染色標(biāo)本制作要點(diǎn)

      試驗(yàn)研究表明,按以下步驟、方法制作染色標(biāo)本,效果較好(詳見表2)。

      表2 姜片吸蟲染色標(biāo)本制作技術(shù)要點(diǎn)

      3.3 染色效果觀察

      腹吸盤位于蟲體前端,呈漏斗狀,大小是口吸盤的4~6倍??谖P后接咽和食道及兩條盲端的腸管,腸管彎曲不分枝,直達(dá)蟲體末端。腹吸盤的后方有彎曲的子宮,子宮內(nèi)充滿蟲卵。卵巢位于子宮與梅氏腺之間,呈佛手狀。卵黃腺呈顆粒狀密布于蟲體兩側(cè),卵黃腺管與梅氏腺相連。兩個(gè)高度分支的睪丸前后排列在蟲體后部中間(詳見圖2、圖3)。

      圖2 姜片吸蟲染色標(biāo)本(10×1倍)

      圖3 姜片吸蟲各器官結(jié)構(gòu)(5×4倍)

      4 分析與討論

      4.1 試驗(yàn)特點(diǎn)

      蟲體固定液脫去、蟲體制薄、染色、脫水、脫色、透明、裝片等步驟,仍處于摸索試驗(yàn)階段,每個(gè)步驟順序及處理時(shí)間均直接影響制片效果。尤其染色對(duì)象是福爾馬林固定20多年的姜片吸蟲,蟲體較大、較厚,彈性差、易破損,蟲體制薄受壓后染液及透明液難于滲透,染色標(biāo)本制作難度增加,合理調(diào)整染色及透明時(shí)間是染色標(biāo)本制作關(guān)鍵。

      4.2 體會(huì)

      各種蟲體標(biāo)本可長(zhǎng)久地浸于甲醛液中保存,但在染色前均須重新放置于70%、50%、30%酒精后才能用于染色;蟲體制薄是長(zhǎng)期浸于甲醛液中姜片吸蟲染色片制作關(guān)鍵,采用文件夾子逐漸施壓蟲體,漸漸變薄,不然蟲體易破碎;染色使用的染液是德氏蘇木素染液,其染色時(shí)間染色時(shí)間為16h;脫色以肉眼觀察蟲體表面為淡紅色,時(shí)間約為5~12min;通過30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%酒精脫水時(shí)間依次為 35min、40min、45min、40min、30min、50min、60min;透明時(shí)間為22h;制片效果較好。

      4.3 出現(xiàn)的問題及解決辦法

      比對(duì)課本介紹的制作方法進(jìn)行標(biāo)本制作,標(biāo)本的顏色過淺,不易在顯微鏡下觀察。經(jīng)研究分析,顏色過淺原因:一是由于肥厚蟲體制薄受壓后細(xì)胞間隙變小,染液不易滲透而著色困難,二是染色時(shí)間較短、脫色時(shí)間較長(zhǎng),調(diào)整時(shí)間后標(biāo)本的著色效果良好。其次,標(biāo)本觀察中出現(xiàn)結(jié)構(gòu)層次不明顯、界限模糊的現(xiàn)象,改善透明時(shí)間后,標(biāo)本的結(jié)構(gòu)層次明顯。再次,有的標(biāo)本制成后發(fā)現(xiàn)有的蟲體邊緣破損和起霧現(xiàn)象,破損原因是蟲體固定時(shí)間較長(zhǎng)彈性較差,制薄受壓過大過急。而起霧原因是酒精梯度脫水時(shí)間不當(dāng),改善后問題被解決。

      [1]李國(guó)清主編,獸醫(yī)寄生蟲學(xué)(雙語(yǔ)版)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2006(7):113~114.

      [2]汪明主編,獸醫(yī)寄生蟲學(xué).[M].第3版,北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2004(1):266.

      [3]趙輝元主編,家畜寄生蟲與防制學(xué)[M].長(zhǎng)春:吉林科學(xué)技術(shù)出版社,1996(7).

      [4]唐芬.肝片形吸蟲制片標(biāo)本的制作技術(shù)[J].山東畜牧獸醫(yī).2009,30(3):9~11.

      [5]肖芳萍.不同保存期吸蟲標(biāo)本胭脂紅染色時(shí)間的比較[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,2002(32):41.

      [6]徐會(huì)梅.片形吸蟲標(biāo)本制作方法改進(jìn)[J].山東畜牧獸醫(yī),2006(1).47~48.

      [7]孔繁瑤主編.家畜寄生蟲學(xué)(第1版)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)學(xué)出版社,1981(6):472~473.

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