冰溫保存腎表皮細(xì)胞及其滲透特性的實驗研究

梁飛，諸凱，2，王雅博

（1天津商業(yè)大學(xué)天津市制冷技術(shù)重點實驗室，天津300134；2天津大學(xué)中低溫?zé)崮芨咝Ю媒逃恐攸c實驗室，天津300072）

冰溫保存技術(shù)[1-2]是一種新的生物低溫保存方法。冰溫是指從0 ℃開始到生物組織凍結(jié)溫度（即冰點）為止的溫度區(qū)域，在這個溫度范圍內(nèi)保存細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)外都不產(chǎn)生冰晶[3-4]。與目前臨床醫(yī)學(xué)廣泛使用的生物冷凍保存方法相比，避開了冰晶對細(xì)胞造成傷害，而且有助于細(xì)胞機(jī)能的快速恢復(fù)。研究表明，當(dāng)降溫速率小到一定數(shù)值時[5]，細(xì)胞內(nèi)的水分有足夠的時間能從細(xì)胞內(nèi)滲透出來，從而降低胞內(nèi)自由水含量，通過這種方法可以很好的抑制胞內(nèi)冰的產(chǎn)生，對細(xì)胞的低溫保存有促進(jìn)作用[6-7]。

通常情況下，細(xì)胞保存前都會添加低溫保護(hù)劑（cryoprotective agent，CPA），以有效的降低細(xì)胞冰點[8-10]。在加入一定濃度的CPA后，細(xì)胞膜內(nèi)外會出現(xiàn)滲透壓不平衡，導(dǎo)致水和CPA同時通過細(xì)胞膜進(jìn)出細(xì)胞，細(xì)胞體積也隨之改變，當(dāng)細(xì)胞體積變化超越細(xì)胞膜所能承受范圍，將會對細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的損傷，即滲透損傷。決定細(xì)胞形態(tài)變化的參數(shù)[11-12]主要有兩個，細(xì)胞膜水滲透系數(shù)（Lp）和細(xì)胞膜 CPA的滲透系數(shù)（Ps）。對這兩個參數(shù)的研究有助于冰溫保存細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展。

細(xì)胞膜對水分的滲透特性可以通過細(xì)胞體積隨外界環(huán)境（滲透壓）的變化來反映。研究表明，細(xì)胞膜腎表皮細(xì)胞的相變溫度在?5～?8 ℃，研究細(xì)胞冰溫保存過程，就應(yīng)在0 ℃附近溫度范圍中測定細(xì)胞膜的滲透特性。眾多研究者利用多種方法對細(xì)胞膜的滲透特性進(jìn)行了研究。Chen等[13]利用微型灌注設(shè)備，研究了鼠樹突細(xì)胞在二甲基亞砜溶液中的滲透系數(shù)，得到了 22 ℃下水的滲透系數(shù)為 0.17 μm/(atm·min)，CPA的滲透系數(shù)為0.63×10?3cm/min。Wang等[14]測量了4 ℃時牛卵母細(xì)胞在胚泡期和四分體時期的滲透參數(shù)，分別為0.08 um/(atm·min)、0.0011 cm/min 和 0.14 um/(atm·min)、0.0029 cm/min。Liu等[15]測量了常溫時兔卵母細(xì)胞在二甲基亞砜、乙二醇和甘油溶液中的滲透參數(shù)。

本研究選取了–4 ℃為冰溫保存溫度，選?。ìF(xiàn)行臨床使用的）4 ℃和0 ℃為對照實驗，并稱其為常溫保存溫度。主要研究內(nèi)容是通過實驗的方法測量腎臟表皮細(xì)胞的滲透特性，主要有細(xì)胞的等滲體積（Viso）、非滲透體積（Vb）、細(xì)胞膜對水的滲透系數(shù)（Lp）及其活化能（Ea），細(xì)胞膜對CPA的滲透系數(shù)（Ps）及其活化能（Ea），并且對細(xì)胞進(jìn)行長時間保存，對比細(xì)胞的存活率，找出最優(yōu)保存溫度。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及實驗材料

儀器：光學(xué)顯微鏡，Olympus BX-51，日本；冷熱臺及控制系統(tǒng)，Linkam THMS600，英國；CCD圖像采集裝置；細(xì)胞培養(yǎng)箱；安全柜；Innovatis CASY?TT，Roche，瑞士。

實驗材料：DMEM培養(yǎng)基、小牛血清、雙抗、臺盼蘭染色劑、磷酸鹽緩沖液（PBS）、二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇（EG）、丙三醇（GLY）。

實驗所用細(xì)胞為 293T細(xì)胞，將細(xì)胞放入完全培養(yǎng)基（90%DMEM培養(yǎng)基、10%小牛血清、1%雙抗——除特殊說明，本文所提到的百分比均為體積分?jǐn)?shù)）中生長，配置好后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中保持溫度37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的環(huán)境。待細(xì)胞培養(yǎng)成熟后，將培養(yǎng)皿取出，在安全柜中操作將培養(yǎng)液吸入離心管，以800 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，然后利用血球計數(shù)板配置出4×105/mL細(xì)胞懸液。

1.2 實驗方法

1.2.1 圖像采集

細(xì)胞的精確控制溫度通過一套冷熱臺及其控制系統(tǒng)實現(xiàn)，如圖1所示。左側(cè)a部分是該系統(tǒng)的控制部分，由冷熱臺（BCS-196）、CCD 圖像數(shù)字采集系統(tǒng)、溫度控制臺（Linksys32）和PC端成像軟件組成。樣品池放置在顯微鏡（Olympas BX51）載物臺上，可實現(xiàn)在–196～125 ℃范圍內(nèi)降溫和加熱，還可以實現(xiàn)以0.1～150 ℃/min的降溫/升溫速率精確控溫。該冷臺通過液氮流進(jìn)行降溫，通過電加熱進(jìn)行加熱，并且通過鉑電阻熱電偶對其溫度進(jìn)行監(jiān)測[16]。

圖1 冷熱臺及其控溫系統(tǒng)和細(xì)胞滲透原理圖

圖1右側(cè)b部分是細(xì)胞滲透原理的示意圖，為更清楚表達(dá)實驗過程，將該部分的圖形比例擴(kuò)大表示，尤其是細(xì)胞的尺寸。如圖所示，載玻片和蓋玻片之間充滿細(xì)胞懸液，由于液體表面張力的作用，是兩玻片緊緊吸附，保證了玻片之間是單層細(xì)胞。高濃度的灌注液（冷凍保護(hù)液或 NaCl 溶液）從左側(cè)導(dǎo)入，灌注溶液的濃度高于細(xì)胞培養(yǎng)液的濃度，其濃度差是驅(qū)動灌注液從左向右流動的動力，兩者混合后從右側(cè)流出平，最終細(xì)胞周圍溶液的濃度會達(dá)到灌注液的濃度，細(xì)胞在此過程中，形態(tài)會產(chǎn)生變化，通過正上方的鏡頭傳入a部分的計算機(jī)成像軟件[17-18]。

1.2.2 圖像處理方法

本研究通過顯微鏡觀察法測量細(xì)胞的體積，假設(shè)細(xì)胞為理想球體模型，通過上述系統(tǒng)可得到實驗過程中的細(xì)胞圖片，通過測量細(xì)胞的二維投影面積，再經(jīng)過計算可以推斷細(xì)胞的體積。Image-Pro plus圖像分析軟件將細(xì)胞圖片處理成灰度不同的像素點，在500倍鏡下，每個像素點對應(yīng)的面積為0.138 μm×0.138 μm，通過對像素點計數(shù)，可得到細(xì)胞的實際面積。每次選取3～5個細(xì)胞，測量3次，求平均值。低溫顯微鏡得到的二維投影面積與體積的關(guān)系如式（1）。

1.2.3 細(xì)胞非滲透體積Vb的計算

將滲透壓濃度為118 Osmoles/kg、185 Osmoles/kg、260 Osmoles/kg、302 Osmoles/kg、670 Osmoles/kg、863 Osmoles/kg、1349 Osmoles/kg、1583 Osmoles/kg、1741 Osmoles/kg、2252 Osmoles/kg、2682 Osmoles/kg、2800 Osmoles/kg、3186 Osmoles/kg 的 NaCl溶液，按上述方法進(jìn)行細(xì)胞滲透試驗。細(xì)胞分別會對以上溶液呈現(xiàn)出不同的相應(yīng)，最終細(xì)胞的內(nèi)外溶液會達(dá)到滲透平衡，細(xì)胞體積的變化過程由圖像采集系統(tǒng)記錄下來，其最終的平衡體積Veq可以表述為Boyle van’t Hoff關(guān)系式[19]，如式（2）。

式中，Viso為細(xì)胞在等滲溶液中（即滲透壓為Miso，mmol/kg）的體積，一般取細(xì)胞的初始體積，μm3；Veq為細(xì)胞在滲透壓為M的溶液中的平衡體積，μm3；Vb為細(xì)胞的非等滲體積，μm3。

從式（2）可以看出，細(xì)胞的相對體積Veq/Viso與溶液的相對滲透壓M/Miso的倒數(shù)呈線性關(guān)系，將實驗數(shù)據(jù)作圖并進(jìn)行線性擬合，可以得到直線在y軸的截距即為細(xì)胞的非滲透體積比Vb/Viso。

1.2.4 細(xì)胞膜滲透參數(shù)（Lp、Ps）的測定

當(dāng)溶液中只有非滲透性溶質(zhì)（如NaCl）存在時，水的滲透系數(shù)可以利用一個描述水分傳輸率的微分方程得到，如式（3）。

在有可滲透性溶質(zhì)（CPA）、不可滲透性溶質(zhì)（NaCl）和溶劑（H2O）共存的三元溶液中，水的傳輸和CPA的滲透同時存在并且相互影響，可采用兩參數(shù)模型（The two-parameter model）[20-21]來描述作為細(xì)細(xì)胞膜傳輸動力模型，模型由一對耦合的微分方程組成，式（4）表示細(xì)胞體積隨時間的變化，式（5）表示胞內(nèi)可滲透性溶質(zhì)（CPA）的物質(zhì)的量隨時間的變化。

其中，Vs（t）與Ns（t）的關(guān)系如式（6）。

Lp、Ps的值可以通過將高滲CPA溶液灌注入細(xì)胞懸液后所獲取的細(xì)胞體積變化數(shù)據(jù)進(jìn)行最小二乘曲線擬合得到。

1.2.5 活化能Ea的計算

通過上面分析，Lp、Ps可以通過分析實驗數(shù)據(jù)得到，同時，Lp、Ps所對應(yīng)的活化能可以用阿倫尼烏斯關(guān)系式[22][式（7）]表示。

式中，P為細(xì)胞膜的滲透參數(shù)（Lp或Ps）；P0為在參照溫度下的值。

對式（7）取自然對數(shù)，整理得式（3）。

由此可知，ln(P)是關(guān)于1/T的方程，將計算值與溫度值做線性擬合，其斜率為?Ea/R，由此可以得到活化能的值。

1.2.6 細(xì)胞存活率實驗

為了研究冰溫保存細(xì)胞的效果，將不同的冷凍保護(hù)劑加入細(xì)胞懸液中，放入冰溫庫進(jìn)行長時間保存，利用細(xì)胞計數(shù)分析儀 Innovatis CASY?TT（Roche）檢驗細(xì)胞的存活率。

將細(xì)胞濃度為 4×105/mL的細(xì)胞懸液配置好之后，分別進(jìn)行以下兩組實驗：①向細(xì)胞懸液加入15%的DMSO試劑，分別放入不同的環(huán)境溫度中（4 ℃、0 ℃、–4 ℃），每12 h記錄一次存活率，到48 h為止。②向細(xì)胞懸液中分別加入15%不同種類的低溫保護(hù)劑二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇（EG）、甘油（GLY），并放置于–4 ℃的環(huán)境溫度中，每12 h記錄一次存活率，到48 h為止。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞非滲透體積的測量

當(dāng)細(xì)胞在高滲溶液中時，細(xì)胞內(nèi)水分外流，體積發(fā)生皺縮，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓相等時，細(xì)胞體積達(dá)到滲透平衡。在常溫下，記錄細(xì)胞在不同滲透壓NaCl溶液內(nèi)的滲透平衡過程的圖像，利用上述圖像處理方法對不同滲透壓下的平衡體積進(jìn)行處理。首先，測量細(xì)胞在等滲溶液中的體積，通過多次觀察統(tǒng)計，腎表皮細(xì)胞的平均等滲體Viso=2472.58 μm3。然后，測定細(xì)胞在不同滲透環(huán)境中平衡后的體積數(shù)據(jù)，得到腎表皮細(xì)胞隨滲透壓變化規(guī)律，如圖2所示，并進(jìn)行最小二乘法線性擬合，得到Boyle van’t Hoff曲線，并且外延該直線至無限大濃度，即圖2中y軸截距位置，可以得到細(xì)胞的非滲透體積Vb=0.22Viso，即Vb=543.9676 μm3，其擬合系數(shù)r2=0.96175。

2.2 細(xì)胞滲透系數(shù)的測量

細(xì)胞在高滲的 NaCl溶液中，在胞內(nèi)外滲透壓差的作用下，水分會通過細(xì)胞膜流出細(xì)胞。而 Na離子進(jìn)出細(xì)胞需要消耗能量，它對細(xì)胞膜來說是一種非滲透性溶質(zhì)，因此只有水分子通過細(xì)胞膜，如圖3所示，在75 s以后，細(xì)胞體積下降到0.45Vb左右保持滲透平衡，在一定范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。這說明在整個滲透過程中只有水分進(jìn)出，而 Na離子未轉(zhuǎn)移。將細(xì)胞變化圖片在軟件中進(jìn)行處理，得到細(xì)胞體積隨時間變化的數(shù)據(jù)，利用Matlab（MathWorks，美國）軟件進(jìn)行處理，根據(jù)式（3）采用Levenberg-Marquard法進(jìn)行曲線擬合，可得到水的滲透系數(shù)Lp，如表1列出了3種低溫保護(hù)劑在不同溫度時的滲透參數(shù)值。

圖2 腎表皮細(xì)胞的Boyle van’t Hoff關(guān)系曲線

圖3 細(xì)胞在NaCl溶液中時體積隨時間的變化曲線

圖4左圖顯示的是初始時刻，0 ℃時細(xì)胞在15%的二甲基亞砜溶液中的圖像，右圖顯示的是左圖方框中細(xì)胞在0～300 s內(nèi)，各個時間點的體積變化圖像，通過Image-Pro plus軟件處理可得到細(xì)胞體積的數(shù)據(jù)。通過數(shù)據(jù)可以得到細(xì)胞在二甲基亞砜溶液中的體積變化曲線，如圖5和圖6所示。在50 s附近時，細(xì)胞體積降到最小值，在以后的時間內(nèi)，細(xì)胞體積逐漸上升，該圖與圖3相比有很大區(qū)別。很顯然在50 s前，細(xì)胞外溶液滲透壓大于胞內(nèi)，水分從細(xì)胞內(nèi)流出，細(xì)胞體積急劇減小，在50 s左右達(dá)到平衡；在50 s之后，隨著二甲基亞砜分子逐漸進(jìn)入細(xì)胞，水分重新回到了細(xì)胞內(nèi)，因此細(xì)胞體積有所回升。將細(xì)胞體積變化數(shù)據(jù)，根據(jù)式（4）～式（6）利用 Levenberg–Marquard方法進(jìn)行曲線擬合，可得到水的滲透系數(shù)Lp和DMSO的滲透系數(shù)Ps，數(shù)據(jù)見表1。

表1 腎細(xì)胞在不同低溫保護(hù)劑中的滲透參數(shù)

圖4 15%的DMSO溶液中細(xì)胞圖像

圖6 –4 ℃時細(xì)胞體積變化曲線

圖5是在0 ℃、4 ℃和–4 ℃下，細(xì)胞在15%的二甲基亞砜溶液中的體積變化曲線。觀察可知，細(xì)胞體積變化趨勢一致，都是細(xì)胞體積先急劇減小，然后逐漸變大。但是，在同一時間點上溫度越低，細(xì)胞體積越大。同時，隨溫度的降低，細(xì)胞皺縮到最小體積的時間越長，這個最小體積也隨溫度的降低而增大。這是由于溫度對低溫保護(hù)劑的滲透系數(shù)影響所造成的，觀察表1的數(shù)據(jù)可知，二甲基亞砜的Lp和Ps值均隨溫度的下降而減小，說明水和二甲基亞砜的滲透能力均隨溫度的下降而降低，尤其是在–4 ℃時，Lp和Ps值均比零上溫度低一個數(shù)量級，這正說明了滲透參數(shù)受溫度影響嚴(yán)重。

圖6是細(xì)胞在二甲基亞砜、乙二醇和甘油溶液中的體積變化曲線，觀察曲線可知，三者曲線變化趨勢一致，在同一時間點上，甘油的體積最大，二甲基亞砜和乙二醇的體積相差不大。甘油的曲線下降的最慢，最小體積也是三者中最大的，二甲基亞砜和乙二醇的曲線比較相似，根據(jù)表1數(shù)據(jù)可知，二甲基亞砜和乙二醇在各個溫度的滲透參數(shù)都比較接近，而甘油的滲透參數(shù)小于上述兩者，可見甘油的滲透能力最下小。

2.3 滲透系數(shù)所對應(yīng)的活化能

圖7顯示的是細(xì)胞在二甲基亞砜溶液中測得的水的滲透系數(shù)Lp與絕對溫度T的倒數(shù)關(guān)系圖，對其進(jìn)行最小二乘法線性擬合，根據(jù)式（8）可以計算得到細(xì)胞對水的活化能。利用同樣方法可得到其他CPA中活化能的數(shù)據(jù)，見表2。

2.4 細(xì)胞的存活率

在經(jīng)過冰溫保存過程中，細(xì)胞的質(zhì)量會隨著時間逐漸下降，細(xì)胞活性逐漸降低，直至變?yōu)樗兰?xì)胞，一般認(rèn)為，當(dāng)活細(xì)胞的存活率下降到50%以下時，生存環(huán)境惡化，組織將壞死。

圖7 腎細(xì)胞對水的滲透系數(shù)的阿侖尼烏斯圖

表2 腎細(xì)胞的活化能

圖8 不同溫度下腎細(xì)胞存活率曲線

通過上述方法，利用細(xì)胞計數(shù)分析儀Innovatis CASY?TT對冰溫保存的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)測量，得到細(xì)胞存活率數(shù)據(jù)。由圖8可見，細(xì)胞在36 h之前，曲線小幅度平穩(wěn)下降，說明細(xì)胞在這段時間沒有經(jīng)歷太大變化，依舊保持活性；在36 h之后， 曲線出現(xiàn)大幅下降，說明細(xì)胞開始出現(xiàn)大量的壞死，在達(dá)到72 h的時候，存活率均低于50%，已經(jīng)不能在進(jìn)行培養(yǎng)。觀察可知，0 ℃曲線在各個時間點基本都高于其他曲線，?4 ℃曲線的次之，4 ℃曲線最低，這說明相對其他兩個溫度來說，0 ℃的環(huán)境對細(xì)胞保存最有益，最佳保存溫度在0～?4 ℃之間。圖9顯示了0 ℃時細(xì)胞在3種低溫保護(hù)劑中保存后存活率的曲線，其變化趨勢與圖8的趨勢相似，同樣說明在36 h之前，細(xì)胞生長良好，能保持很高的活性，在36 h之后，細(xì)胞出現(xiàn)大量壞死。同時，3種冷凍保護(hù)劑中，甘油的曲線高于其他兩曲線，在36 h之前，二甲基亞砜的曲線和甘油的曲線非常相似，乙二醇的曲線最低，這說明針對腎臟表皮細(xì)胞而言，3種低溫保護(hù)劑對甘油和二甲基亞砜的保護(hù)作用較好，乙二醇相對較差。

3 結(jié) 論

本文利用顯微數(shù)字圖像采集系統(tǒng)，在冰溫溫度和常溫溫度下，對腎臟表皮細(xì)胞的滲透過程進(jìn)行了研究。觀察了細(xì)胞在非等滲環(huán)境中的滲透響應(yīng)，得到了細(xì)胞的等滲體積Viso=2472.58 μm3，非滲透體積Vb=543.9676 μm3。并且根據(jù)細(xì)胞在CPA溶液中的滲透過程，得出了細(xì)胞膜對水的滲透系數(shù)（Lp）及細(xì)胞膜對 CPA的滲透系數(shù)（Ps）。最后進(jìn)行保存，利用細(xì)胞計數(shù)分析儀測量了細(xì)胞存活率隨時間變化趨勢。得出如下結(jié)論。

圖9 0 ℃時不同保護(hù)劑中細(xì)胞存活率曲線

（1）通過對比低溫保護(hù)劑在不同溫度下滲透系數(shù)的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)滲透系數(shù)受溫度影響較大，隨著溫度的減小，滲透系數(shù)逐漸小，其滲透能力也相應(yīng)降低，即細(xì)胞在冰溫環(huán)境下的滲透系數(shù)低于常溫下的滲透系數(shù)。

（2）通過觀察細(xì)胞在不同溫度下的保存狀況，發(fā)現(xiàn)腎表皮細(xì)胞的最佳保存溫度范圍在 0～?4 ℃之間，即細(xì)胞的冰溫保存效果比現(xiàn)行臨床常用的4～0 ℃范圍的保存效果更好。同時根據(jù)實驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，即使在精確控溫的冰溫庫中保存的細(xì)胞，保存時間不宜超過36 h，超過以后細(xì)胞質(zhì)量急劇下降，影響細(xì)胞功能。因此在實際臨床應(yīng)用上，保存時間更不宜超過24 h為好。

（3）通過觀察細(xì)胞在不同類型低溫保護(hù)劑中的保存情況，發(fā)現(xiàn)在36 h內(nèi)，甘油、二甲基亞砜、乙二醇3種低溫保護(hù)劑的保存效果，依次降低，但是三者的保存效果相差不大。

符 號 說 明

A——細(xì)胞投影面積，μm2

Ea——活化能，kcal/mol

Lp——水對細(xì)胞膜的滲透系數(shù)，μm/(atm·min)

M——摩爾滲透壓濃度，Osmoles/kg

m——質(zhì)量摩爾濃度，mol/kg

N——物質(zhì)的量，mol

Ps——CPA對細(xì)胞膜的滲透系數(shù)，cm/min

R——氣體常數(shù)，kcal/(mol·K)

T——絕對溫度，K

t——時間，s

V——細(xì)胞體積，μm3

Vb——非滲透體積，μm3

下角標(biāo)

c——總數(shù)

w——水

s——分滲透性溶質(zhì)

n——滲非透性溶質(zhì)

o——初始值

上角標(biāo)

e——細(xì)胞外

i ——細(xì)胞內(nèi)

[1]Yoichi M，Wei T，Kaibori M，et al.A novel conception for liver preservation at a temperature just above freezing point[J].Journal of Surgical Research，1999，81（2）：216-223.

[2]Soltys K A，Batta A K.Successful nonfreezing，subzero preservation of rat liver with 2,3-butanediol and type Ⅰ antifreeze protein[J].Journal of Surgical Research，2001，96（1）：30-34.

[3]Yang C Y，Lee P T，Lin T T et al.Effect of cooling rate and cryoprotectant concentration on intracellular ice formation of small abalone (Haliotis diversicolor) eggs[J].Cryobiology，2013，67（1）：7-16.

[4]Mori Shoji，Choi Jeunghwan，Devireddy R V，et al.Calorimetric Bischof.Calorimetric.measurement of water transport and intracellular ice formation during freezing in cell suspensions[J].Cryobiology，2012，65（3）：242-255.

[5]Varisli O，Scott H，Agca C，et al.The effects of cooling rates and type of freezing extenders on cryosurvival of rat sperm[J].Cryobiology，2013，67（2）：109-116.

[6]Balasubramanian S K，Bischof J.C，Hubel A.Water transport and IIF parameters for a connective tissue equivalent.[J].Cryobiology，2006，52（1）：62-73.

[7]Mazur P.Kinetics water loss from cells at sub zero temperature and the likelihood of intercellular freezing[J].Journal of General Physiology，1963，47（3）：347-369.

[8]馬學(xué)虎，范文霞，潘廣生.冷凍保護(hù)劑導(dǎo)入細(xì)胞過程的模擬和優(yōu)化[J].熱科學(xué)與技術(shù)，2008，7（4）：324-330.

[9]Yildiz C，Mullen B，Jarvi K，et al.Effect of different cryoprotectant agents on spermatogenesis efficiency in cryopreserved and grafted neonatal mouse testicular tissue[J].Cryobiology，2013，67（1）：70-75.

[10]Liang Y Y，Srirattana K，Phermthai T，et al.Effects of vitrification cryoprotectant treatment and cooling method on the viability and development of buffalo oocytes after intracytoplasmic sperm injection[J].Cryobiology，2012，65（2）：151-156.

[11]Agca Y，Liu J，McGrath J J，et al.Membrane permeability characteristics of metaphase Ⅱ mouse oocytes at various temperatures in the presence of Me2SO[J].Cryobiology，1998，36（4）：287-300.

[12]Noiles E E，Mazur P，Watson P F，et al.Determination of water permeability coefficient for human spermatozoa and its activation energy[J].Biology of Reproduction，1993，48（1）：99-109.

[13]Chen H H，Shen H，Heimfeld S，et al.A microfluidic study of mouse dendritic cell membrane transport properties of water and cryoprotectants[J].International Journal of Heat and Mass Transfer，2008，51（23-24）：5687-5694.

[14]Wang X，Naib A.A，Sun D W，et al.Membrane permeability characteristics of bovine oocytes and development of a step-wise cryoprotectant adding and diluting protocol[J].Cryobiology， 2010，61（1）：58-65.

[15]Liu J，Mullen S，Meng Q G，et al.Determination of oocyte membrane permeability coefficients and their application to cryopreservation in a rabbit model[J].Cryobiology，2009，59（2）：127-134.

[16]Spindler R，Rosenhahn B，Hofmann N，et al.Video analysis of osmotic cell response during cryopreservation.[J].Cryobiology，2012，64（3）：250-260.

[17]Taylor M J，Baicu S C.Current state of hypothermic machine perfusion preservation of organs：The clinical perspective[J].Cryobiology，2010，60（3）：S20-S35.

[18]Gao D Y，Mcgrath J J，Tao J，et al.Membrane transport properties of mammalian oocytes - a micropipette perfusion technique[J].Reprod Fertil，1994 ，102（2）：385-392.

[19]Peckys D，Mazur P.Regulatory volume decrease in COS-7 cells at 22 C and its influence on the Boyle van’t Hoff relation and the determination of the osmotically inactive volume[J].Cryobiology，2012，65（1）：74-78.

[20]Kleinhans F W.Membrane permeability modeling：Kedem-Katchalskyvs.a two-parameter formalism[J].Cryobiology，1998，37（4）：271-289.

[21]McGrath J J.Quantitative measurement of cell membrane transport：Technology and applications[J].Cryobiology，1997，34（4）：315-334.

[22]Noiles E E，Thompson K A，Storey B T.Water permeability，Lp ，of the mouse sperm plasma membrane and its activation energy are strongly dependent on interaction of the plasma membrane with the sperm cytoskeleton[J].Cryobiology，1997，35（1）：79-92.