匡斌　王慶昱　宋容　等

[摘要] 目的 探討誘導(dǎo)后ATDC5軟骨細(xì)胞在20%形變的周期性牽張力及基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）刺激下，趨化因子受體4（CXCR4）、白介素（IL）-6及膠原X的表達(dá)變化，以期深入研究SDF-1/CXCR4信號(hào)軸在軟骨細(xì)胞分化中的作用機(jī)制。方法 ATDC5細(xì)胞系經(jīng)胰島素鐵硒傳遞蛋白（ITS）誘導(dǎo)3周后，分為加力和不加力兩大組，每大組又分為對(duì)照組和SDF-1組。對(duì)加力組施以20%形變的拉伸力12 h。加力結(jié)束后，對(duì)各組細(xì)胞提取總蛋白，對(duì)CXCR4、IL-6及膠原X的蛋白表達(dá)進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果 在不加力狀態(tài)下，給予SDF-1刺激后，軟骨細(xì)胞CXCR4、IL-6及膠原X的表達(dá)都出現(xiàn)了不同程度的增強(qiáng)；而在20%形變力和SDF-1的雙重刺激下，此3種因子的表達(dá)出現(xiàn)進(jìn)一步增強(qiáng)。結(jié)論 在異常應(yīng)力作用下，SDF-1可通過上調(diào)其特異性受體CXCR4的表達(dá)進(jìn)而增大與其結(jié)合的效率，最終促使SDF-1/CXCR4信號(hào)軸的激活，促進(jìn)IL-6等炎癥因子的表達(dá)增強(qiáng)，以及直接促進(jìn)軟骨細(xì)胞的肥大向分化，進(jìn)而膠原X的表達(dá)量增高。

[關(guān)鍵詞] 顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病； 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1； 趨化因子受體4； 周期性張應(yīng)力

[中圖分類號(hào)] Q 257 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.06.015

在關(guān)于顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)?。╫steoarthritis，OA）病因的討論中，異常機(jī)械應(yīng)力越來越受到人們的關(guān)注。應(yīng)力對(duì)髁突軟骨細(xì)胞而言是一種外源性機(jī)械刺激信號(hào)，在異常應(yīng)力作用下，髁突軟骨細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，可能對(duì)關(guān)節(jié)組織造成損害?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）/趨化因子受體4（chemokine receptor 4，CXCR4）相互作用時(shí)，通過誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的釋放如白介素（interleukin，IL）等而引起OA軟骨的破壞[1]。ATDC5細(xì)胞是從AT805胚胎瘤中分離的軟骨前體細(xì)胞系，其為軟骨內(nèi)成骨過程提供了一個(gè)良好的軟骨細(xì)胞礦化成熟體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)０?，廣泛應(yīng)用于軟骨細(xì)胞調(diào)控機(jī)理的研究。本研究擬通過體外誘導(dǎo)ATDC5細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞，并進(jìn)行周期性張應(yīng)力及SDF-1刺激，并分別檢測(cè)CXCR4、IL-6及膠原X的表達(dá)變化，以期在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討SDF-1/CXCR4信號(hào)軸在OA中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

SDF-1（Peprointech公司，英國），抗-CXCR4抗體（兔單克隆來源，Abcam公司，美國），抗-IL-6抗體（兔多克隆來源）、抗-膠原X抗體（山羊多克隆來源）（Santa Cruz公司，美國），ATDC5細(xì)胞系（蘇州百奇生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 ATDC5細(xì)胞系的培養(yǎng)和誘導(dǎo) ATDC5細(xì)胞置于培養(yǎng)基（DMEM/F12）中，加入10%胎牛血清、

50 U·mL-1青霉素、50 U·mL-1鏈霉素。細(xì)胞每2 d換液1次，保持細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，培養(yǎng)瓶放于37 ℃、5%

CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。待細(xì)胞穩(wěn)定后，更換含有10%胰島素鐵硒傳遞蛋白（insulin-transferring-selenium，ITS）的培養(yǎng)液誘導(dǎo)3周。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將誘導(dǎo)的細(xì)胞消化后分別接種于普通六孔板和彈性膜六孔板中，分為加力和不加力兩個(gè)大組，每大組又分對(duì)照組和SDF-1組（100 ng·μL-1）。加入以上試劑8 h后，將彈性膜六孔板連接到可控氣液壓細(xì)胞加載裝置并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，設(shè)置為20%形變的拉伸力，0.2 Hz。連續(xù)加力12 h后，將彈性膜板及普通板上的細(xì)胞用專用刮匙取下。

1.2.3 蛋白提取 無菌PBS洗各組細(xì)胞3次；加入放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）蛋白裂解液；冰上放置20 min；收集裂解液后，

12 000 r·min-1離心10 min；吸取上清，進(jìn)行總蛋白定量，分裝，保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 Western blot檢測(cè) 蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳60 V電泳1.5 h。電轉(zhuǎn)完畢，取下膜片，加入5%脫脂奶粉，于搖床搖蕩封閉1 h以消除非特異背景。封閉完畢，洗掉牛奶，分別加入相應(yīng)一抗（1︰200），4 ℃ 孵育24 h，使一抗與特異蛋白結(jié)合。洗去一抗后，加入相應(yīng)二抗37 ℃ 孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光試劑盒化學(xué)發(fā)光后曝光成像。同時(shí)以β-

actin作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

3 討論

應(yīng)力加載是調(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝的關(guān)鍵因素之

一[2-4]。軟骨組織在受到壓縮力作用的情況下，由于受到膠原及其他細(xì)胞外基質(zhì)的牽拉作用，軟骨細(xì)胞實(shí)際受到的是一種拉伸力[5]。在正?；顒?dòng)的情況下，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞受到大約5%的伸長(zhǎng)[6]。目前國外的研究主要都對(duì)軟骨細(xì)胞施予周期性拉伸力。

軟骨細(xì)胞對(duì)機(jī)械負(fù)荷極度敏感，關(guān)節(jié)軟骨物理化學(xué)環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化可影響軟骨細(xì)胞的新陳代謝[7]。以前使用生物拉伸力培養(yǎng)體系研究[8]發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞承受拉伸力時(shí)可維持其表型，由加力裝置引起的周期性拉伸力可致軟骨細(xì)胞首先增殖，然后成熟和肥大。加力大小對(duì)軟骨細(xì)胞所產(chǎn)生的效應(yīng)非常重要。已有研究[9]證明不同強(qiáng)度的加力，可對(duì)軟骨細(xì)胞功能產(chǎn)生不同作用。低強(qiáng)度的拉伸力會(huì)促進(jìn)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生蛋白聚糖、Ⅱ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)作用，甚至可產(chǎn)生抗炎作用。但在高強(qiáng)度拉伸力作用下，既可通過直接激活核轉(zhuǎn)錄因子kB通路進(jìn)而誘導(dǎo)IL-1等炎癥因子的分泌，也可以直接誘使IL-1、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）9的生成[10]。高強(qiáng)度周期性拉伸力加載于軟骨細(xì)胞中，可減少軟骨基質(zhì)的合成，進(jìn)而導(dǎo)致軟骨組織抵抗外來刺激的能力降低。因此在本實(shí)驗(yàn)中使用強(qiáng)度為20%的拉伸力對(duì)軟骨細(xì)胞更可能產(chǎn)生一種負(fù)面作用。Honda等[11]報(bào)道高強(qiáng)度周期性拉伸力加載于軟骨細(xì)胞中，可使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，從多邊形到紡錘形。而本實(shí)驗(yàn)中使用強(qiáng)度為20%的周期性拉伸力時(shí)，在經(jīng)受加力和/或SDF-1刺激后，軟骨細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常，未發(fā)現(xiàn)壞死細(xì)胞，細(xì)胞排列相對(duì)有序。

已有研究[1]表明SDF-1/CXCR4信號(hào)通路在OA及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者病理進(jìn)程中起關(guān)鍵作用。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明其破壞關(guān)節(jié)軟骨的作用可能是通過骨髓腔及滑膜細(xì)胞分泌高濃度的SDF-1，后者再與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞上的CXCR4受體結(jié)合，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞分泌大量的IL-6及MMP。相關(guān)研究[12]報(bào)道，在人類關(guān)節(jié)炎中，滑膜切除術(shù)致SDF-1濃度降低或抗CXCR4抗體阻止CXCR4的表達(dá)，會(huì)使MMP13表達(dá)降低和減弱軟骨的破壞。這些研究都有力證明SDF-1/CXCR4信號(hào)通路在OA病理進(jìn)程中的重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不加力狀態(tài)下，給予SDF-1刺激后，軟骨細(xì)胞CXCR4、IL-6的表達(dá)都出現(xiàn)了不同程度的增強(qiáng)；而在20%形變力和SDF-1的雙重刺激下，此兩種因子的表達(dá)出現(xiàn)進(jìn)一步增強(qiáng)。以上結(jié)果說明，SDF-1刺激可上調(diào)其特異性受體CXCR4的表達(dá)，而隨著受體的上調(diào)，則反過來增加了與配體SDF-1結(jié)合的可能性，最終促使軟骨細(xì)胞SDF-1/CXCR4信號(hào)通路的激活，而該信號(hào)軸下游因子IL-6的表達(dá)增強(qiáng)，也證實(shí)了這種推測(cè)。20%的拉伸力超出了軟骨細(xì)胞正常的受力范圍，這正是為了模擬體內(nèi)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞由于漸進(jìn)性咬合紊亂而受到的異常力刺激。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)此種異常力的確可對(duì)軟骨細(xì)胞CXCR4等的表達(dá)產(chǎn)生促進(jìn)作用，這也與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

在機(jī)械負(fù)荷下，軟骨中的膠原X是敏感因子之一[8]，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組軟骨細(xì)胞在加力狀態(tài)下膠原X的表達(dá)比不加力時(shí)更強(qiáng)，證實(shí)在此種異常力作用下，軟骨細(xì)胞出現(xiàn)肥大化傾向，這也與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組軟骨內(nèi)成骨增強(qiáng)及鈣化軟骨增厚相一致。此外，SDF-1這種趨化因子似乎還可促進(jìn)軟骨細(xì)胞X型膠原的表達(dá)，在加力狀態(tài)下這種趨勢(shì)仍然明顯。這說明SDF-1/CXCR4信號(hào)軸可直接調(diào)控軟骨細(xì)胞的分化。

綜上所述，軟骨細(xì)胞在異常應(yīng)力作用下，SDF-1可通過上調(diào)其特異性受體CXCR4的表達(dá)進(jìn)而增大與其結(jié)合的效率，最終促使SDF-1/CXCR4信號(hào)軸激活，一方面導(dǎo)致如IL-6等炎癥因子的表達(dá)增強(qiáng)，從而對(duì)軟骨組織造成直接破壞；另一方面還可直接促進(jìn)軟骨細(xì)胞的肥大向分化，從而促進(jìn)髁突軟骨的軟骨內(nèi)成骨，促使其發(fā)生間接退變。

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（本文編輯 杜冰）