致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌外膜蛋白A前體蛋白的克隆表達(dá)

張笛+張勇攀+錢文正+于恩琪+秦愛建+金文杰

摘要：以致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌分離株G8107菌株基因組DNA為模板，用PCR法擴(kuò)增ompA precursor基因，PCR產(chǎn)物用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物回收與相同黏性末端的表達(dá)載體 pET-32a（+）連接構(gòu)建表達(dá)ompA precursor的重組質(zhì)粒，將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌BL21（DE3），抽提質(zhì)粒，酶切鑒定及測序正確后誘導(dǎo)表達(dá)。對轉(zhuǎn)化菌株以 IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)后，裂解細(xì)菌，離心，上清進(jìn)行 SDS-PAGE鑒定。測序結(jié)果顯示，ompA precursor基因大小為 1 014 bp，編碼 338 個氨基酸殘基，蛋白相對分子質(zhì)量約為36。原核表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE 分析表明，以28 ℃ 1.0 mmol/L 的 IPTG 誘導(dǎo)6 h，該基因表達(dá)效果最好。經(jīng)Western Blot檢測，表達(dá)的重組蛋白可與抗His標(biāo)簽蛋白單抗反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌；外膜蛋白前體；克隆與表達(dá)

中圖分類號：S858.33 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0032-03

鵝卵黃性腹膜炎是一種主要發(fā)生于產(chǎn)蛋種鵝的疾病^[1]。該病的發(fā)生主要是由于公鵝生殖器感染大腸桿菌，在交配的過程中傳染給母鵝，導(dǎo)致輸卵管感染大腸桿菌出現(xiàn)炎癥，最終導(dǎo)致卵黃性腹膜炎。該病會導(dǎo)致產(chǎn)蛋母鵝生產(chǎn)性能下降甚至絕產(chǎn)，嚴(yán)重的導(dǎo)致產(chǎn)蛋母鵝死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失^[2-4]。大腸桿菌是自然界廣泛存在的條件性致病菌，其被發(fā)現(xiàn)后很長一段時間內(nèi)一直被當(dāng)做腸道內(nèi)的正常菌群而非致病菌，后來人類才認(rèn)識到某些血清型的大腸桿菌對人、畜禽具有致病性，當(dāng)動物機(jī)體抵抗力下降或免疫功能受損時可引發(fā)感染。外膜蛋白A是廣泛存在于革蘭氏陰性腸桿菌外膜上的蛋白，OmpA precursor是大腸桿菌外膜蛋白A的前體蛋白。徐淑華以O(shè)mpA為指示蛋白，研究E.coli的Prlc基因產(chǎn)物對OmpA前體蛋白翻譯后轉(zhuǎn)位功能，結(jié)果表明，Prlc基因產(chǎn)物在一定程度上能增進(jìn)OmpA的轉(zhuǎn)位定域^[5]。OmpA是細(xì)菌抗宿主殺傷因子，能維持細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)完整及細(xì)菌形態(tài)正常，同時在細(xì)菌黏附、侵襲起始過程中起關(guān)鍵作用。OmpA具有良好的免疫原性，是先天免疫系統(tǒng)的重要靶位，也可以在免疫逃逸中發(fā)揮重要作用^[6-8]。由于OmpA 蛋白的生物學(xué)特性，而且在革蘭氏陰性桿菌中OmpA蛋白普遍存在，因此也可以將其作為疫苗的候選分子^[9-10]。本研究選取差異蛋白OmpA前體蛋白，對蛋白進(jìn)行體外克隆表達(dá)，進(jìn)而探索蛋白在細(xì)菌中與宿主的關(guān)系，旨在為揭示蛋白功能及鵝卵黃性腹膜炎發(fā)生機(jī)理提供幫助。

1 材料與方法

1.1 菌種與載體

致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌菌株G8107由揚(yáng)州大學(xué)江蘇省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存。原核表達(dá)載體 pET-32a（+）、大腸桿菌BL21（DE3）均由該實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑

Tryptone、Yeast Extract為Oxiod公司產(chǎn)品；Taq酶、dNTP、10×buffer、1 kb marker、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ購自Fermantes生物工程公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物及凝膠純化回收試劑盒購自Axygen公司；PCR引物由華大基因合成；甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、NBT、咪唑?yàn)锳mresco公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)純化鎳柱購自GE公司；蛋白marker 購自Fermantes公司；His 標(biāo)簽抗體為筆者所在實(shí)驗(yàn)室自制；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank上發(fā)表的大腸桿菌Escherichia coli O157：H7 str. EC1212 的ompA precursor基因序列設(shè)計PCR擴(kuò)增引物，在上游引物5′末端加入EcoRⅠ 限制性酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基，下游引物5′末端加入XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基。引物序列為：上游引物：5′-CTGAATTCCTGGCACTGGCTGGTTTC-3′；下游引物：5′- ATCTCGAGTTAAGCCTGCGGCTGAGT-3′。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 014 bp。

1.4 PCR 擴(kuò)增目的基因

以致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌菌株G8107基因組 DNA 為模板擴(kuò)增ompA precursor基因片段，取新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌菌液，12 000 r/min離心1 min，去上清，沉淀用100 μL超純水重懸，將重懸的沉淀煮沸10 min，-20 ℃凍存10 min，取出融化，12 000 r/min 離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中用于PCR。反應(yīng)條件為 95 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，63 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min 20 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。用PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書操作回收目的基因。

1.5 目的基因 ompA precursor的克隆及測序

回收的 PCR 產(chǎn)物、pET-32a（+）空載體質(zhì)粒用EcoRⅠ、 XhoⅠ雙酶切，再次回收產(chǎn)物，將ompA precursor 2次膠回收產(chǎn)物及雙酶切后的表達(dá)載體pET-32a（+）在連接酶的作用下于16 ℃過夜連接。取連接產(chǎn)物10 μL轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)（CaCl2法），涂布于含0.1%氨芐的LB 瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定正確的為陽性，將陽性細(xì)菌送測序，測序結(jié)果正確的細(xì)菌用于表達(dá)。

1.6 OmpA precursor融合蛋白表達(dá)條件摸索及蛋白純化

經(jīng)鑒定正確新鮮的ompA precursor陽性重組菌及含有pET-32a（+）質(zhì)粒的BL21（DE3）空載體菌按1 ∶100轉(zhuǎn)接種培養(yǎng)3 h，加入 IPTG，終濃度分別為0、0.25、0.5、0.75、1、1.25 mmol/L，28 ℃分別誘導(dǎo) 2、3、4、5、6 h，每隔1 h收獲相應(yīng)細(xì)菌。等體積菌液4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用1 mL無菌PBS溶液洗滌，4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用400 μL無菌超輕水重懸，懸液超聲裂解，裂解液4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，取上清測定濃度，通過 SDS-PAGE 確定蛋白最佳表達(dá)條件。確定最佳表達(dá)條件后采用相同方法大量表達(dá)蛋白，裂解上清經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后用His標(biāo)簽鎳柱對上清進(jìn)行純化。

1.7 Western Blot驗(yàn)證

將經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、純化的上清加 6×上樣buffer混勻，沸水浴10 min，冰浴5 min，離心后取上清進(jìn)行SDS-PAGE。按分子克隆方法，采用電轉(zhuǎn)移方法將膠中蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素薄膜上，5%脫脂乳4 ℃過夜封閉，一抗為筆者所在實(shí)驗(yàn)室自制的抗His 標(biāo)簽蛋白單抗腹水（稀釋度為1 ∶2 000），37 ℃作用1 h，二抗采用AP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG（稀釋度為 1 ∶30 000），37 ℃作用1 h，NBT顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 ompA基因的 PCR 擴(kuò)增和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌G8107基因組為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳，以1 kb marker為參照，在1 000 bp左右位置得到與預(yù)期大小一致的擴(kuò)增條帶，結(jié)果如圖1所示。

將回收的ompA precursor PCR產(chǎn)物、pET-32a（+）空載體質(zhì)粒用EcoRⅠ、 XhoⅠ雙酶切，再次回收產(chǎn)物，進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到5 900、1 014 bp 2個目的條帶，結(jié)果如圖2所示。

將雙酶切后回收的ompA precursor片段及pET-32a（+）載體連接，構(gòu)建pET32a-pre-ompA重組質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒雙酶切后，可得到與目的基因（1 014 bp）及載體（5 900 bp）大小相同的2個片段，如圖3所示。將重組細(xì)菌送測序鑒定，結(jié)果正確。

2.3 pET32a-pre-ompA重組表達(dá)蛋白Western Blot鑒定

將純化后的蛋白上清進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，隨后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上進(jìn)行Western Blot分析，在分子量 54 ku 處可見陽性條帶（圖10）。

3 結(jié)論與討論

鵝卵黃性腹膜炎別稱鵝蛋子瘟，是一種主要發(fā)生于產(chǎn)蛋種鵝的疾病，能導(dǎo)致鵝生產(chǎn)性能下降甚至死亡。目前，有關(guān)鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌的致病機(jī)理仍不清楚。1977 年，Chai等發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的 OmpA 蛋白是大腸桿菌外膜上的主要蛋白^[10]。1984 年 Morona等預(yù)測 OmpA 蛋白為多次跨膜結(jié)構(gòu)^[11]。1998 年 Pautsch等描述了第1個 OmpA 蛋白的晶體結(jié)構(gòu)^[12]。本研究的OmpA precursor為二維電泳差異蛋白。研究表明，大腸桿菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性并且能夠誘導(dǎo)機(jī)體脾淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)了淋巴細(xì)胞活化，在免疫反應(yīng)中具有重要作用^[13]。OmpA 普遍存在于大腸桿菌菌體外膜中，是大腸桿菌重要的毒力因子，參與大腸桿菌對宿主細(xì)胞的黏附作用與侵襲功能^[14]。本研究成功克隆了致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌的外膜蛋白A前體蛋白基因，并在原核表達(dá)載體pET-32a（+）中成功表達(dá)，同時確定了最佳表達(dá)時間、溫度及誘導(dǎo)劑IPTG的濃度。Western Blot結(jié)果表明，融合蛋白能夠與抗His標(biāo)簽蛋白單抗腹水反應(yīng)。由于本研究期望獲得可溶性表達(dá)并盡量保持蛋白原空間構(gòu)象的完整，因此只選擇細(xì)菌裂解上清進(jìn)行鎳柱純化，對于包涵體中的蛋白并未用常用的中性去垢劑例如吐溫、NP40進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純化的蛋白在透析及濃縮的過程中極易發(fā)生析出，同時凍融后極易發(fā)生降解。免疫印跡試驗(yàn)存在雜條帶，初步分析這可能是OmpA前體蛋白發(fā)生降解的原因，應(yīng)作進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]王永坤，田慧芳. 鵝蛋子瘟防治的研究[J]. 中國禽業(yè)導(dǎo)刊，2003，20（11）：19-20.

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1.7 Western Blot驗(yàn)證

將經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、純化的上清加 6×上樣buffer混勻，沸水浴10 min，冰浴5 min，離心后取上清進(jìn)行SDS-PAGE。按分子克隆方法，采用電轉(zhuǎn)移方法將膠中蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素薄膜上，5%脫脂乳4 ℃過夜封閉，一抗為筆者所在實(shí)驗(yàn)室自制的抗His 標(biāo)簽蛋白單抗腹水（稀釋度為1 ∶2 000），37 ℃作用1 h，二抗采用AP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG（稀釋度為 1 ∶30 000），37 ℃作用1 h，NBT顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 ompA基因的 PCR 擴(kuò)增和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌G8107基因組為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳，以1 kb marker為參照，在1 000 bp左右位置得到與預(yù)期大小一致的擴(kuò)增條帶，結(jié)果如圖1所示。

將回收的ompA precursor PCR產(chǎn)物、pET-32a（+）空載體質(zhì)粒用EcoRⅠ、 XhoⅠ雙酶切，再次回收產(chǎn)物，進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到5 900、1 014 bp 2個目的條帶，結(jié)果如圖2所示。

將雙酶切后回收的ompA precursor片段及pET-32a（+）載體連接，構(gòu)建pET32a-pre-ompA重組質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒雙酶切后，可得到與目的基因（1 014 bp）及載體（5 900 bp）大小相同的2個片段，如圖3所示。將重組細(xì)菌送測序鑒定，結(jié)果正確。

2.3 pET32a-pre-ompA重組表達(dá)蛋白Western Blot鑒定

將純化后的蛋白上清進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，隨后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上進(jìn)行Western Blot分析，在分子量 54 ku 處可見陽性條帶（圖10）。

3 結(jié)論與討論

鵝卵黃性腹膜炎別稱鵝蛋子瘟，是一種主要發(fā)生于產(chǎn)蛋種鵝的疾病，能導(dǎo)致鵝生產(chǎn)性能下降甚至死亡。目前，有關(guān)鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌的致病機(jī)理仍不清楚。1977 年，Chai等發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的 OmpA 蛋白是大腸桿菌外膜上的主要蛋白^[10]。1984 年 Morona等預(yù)測 OmpA 蛋白為多次跨膜結(jié)構(gòu)^[11]。1998 年 Pautsch等描述了第1個 OmpA 蛋白的晶體結(jié)構(gòu)^[12]。本研究的OmpA precursor為二維電泳差異蛋白。研究表明，大腸桿菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性并且能夠誘導(dǎo)機(jī)體脾淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)了淋巴細(xì)胞活化，在免疫反應(yīng)中具有重要作用^[13]。OmpA 普遍存在于大腸桿菌菌體外膜中，是大腸桿菌重要的毒力因子，參與大腸桿菌對宿主細(xì)胞的黏附作用與侵襲功能^[14]。本研究成功克隆了致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌的外膜蛋白A前體蛋白基因，并在原核表達(dá)載體pET-32a（+）中成功表達(dá)，同時確定了最佳表達(dá)時間、溫度及誘導(dǎo)劑IPTG的濃度。Western Blot結(jié)果表明，融合蛋白能夠與抗His標(biāo)簽蛋白單抗腹水反應(yīng)。由于本研究期望獲得可溶性表達(dá)并盡量保持蛋白原空間構(gòu)象的完整，因此只選擇細(xì)菌裂解上清進(jìn)行鎳柱純化，對于包涵體中的蛋白并未用常用的中性去垢劑例如吐溫、NP40進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純化的蛋白在透析及濃縮的過程中極易發(fā)生析出，同時凍融后極易發(fā)生降解。免疫印跡試驗(yàn)存在雜條帶，初步分析這可能是OmpA前體蛋白發(fā)生降解的原因，應(yīng)作進(jìn)一步研究。

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[8]Sukumaran S K，Shimada H，Prasadarao N V. Entry and intracellular replication of Escherichia coli K1 in macrophages require expression of outer membrane protein A[J]. Infection and Immunity，2003，71（10）：5951-5961.

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[11]Morona R，Klose M，Henning U. Escherichia coli K-12 outer membrane protein（OmpA） as a bacteriophage receptor：analysis of mutant genes expressing altered proteins[J]. Journal of Bacteriology，1984，159（2）：570-578.

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[13]李曉霞，邱玉玉，王海榮. 腸致病性大腸桿菌外膜蛋白免疫保護(hù)性研究[J]. 中國免疫學(xué)雜志，2007，23（5）：394-397.

[14]宋 舟，陳 偉，張立艷，等. 大腸桿菌外膜蛋白A研究進(jìn)展[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（5）：199-202.

1.7 Western Blot驗(yàn)證

將經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、純化的上清加 6×上樣buffer混勻，沸水浴10 min，冰浴5 min，離心后取上清進(jìn)行SDS-PAGE。按分子克隆方法，采用電轉(zhuǎn)移方法將膠中蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素薄膜上，5%脫脂乳4 ℃過夜封閉，一抗為筆者所在實(shí)驗(yàn)室自制的抗His 標(biāo)簽蛋白單抗腹水（稀釋度為1 ∶2 000），37 ℃作用1 h，二抗采用AP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG（稀釋度為 1 ∶30 000），37 ℃作用1 h，NBT顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 ompA基因的 PCR 擴(kuò)增和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌G8107基因組為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳，以1 kb marker為參照，在1 000 bp左右位置得到與預(yù)期大小一致的擴(kuò)增條帶，結(jié)果如圖1所示。

將回收的ompA precursor PCR產(chǎn)物、pET-32a（+）空載體質(zhì)粒用EcoRⅠ、 XhoⅠ雙酶切，再次回收產(chǎn)物，進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到5 900、1 014 bp 2個目的條帶，結(jié)果如圖2所示。

將雙酶切后回收的ompA precursor片段及pET-32a（+）載體連接，構(gòu)建pET32a-pre-ompA重組質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒雙酶切后，可得到與目的基因（1 014 bp）及載體（5 900 bp）大小相同的2個片段，如圖3所示。將重組細(xì)菌送測序鑒定，結(jié)果正確。

2.3 pET32a-pre-ompA重組表達(dá)蛋白Western Blot鑒定

將純化后的蛋白上清進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，隨后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上進(jìn)行Western Blot分析，在分子量 54 ku 處可見陽性條帶（圖10）。

3 結(jié)論與討論

鵝卵黃性腹膜炎別稱鵝蛋子瘟，是一種主要發(fā)生于產(chǎn)蛋種鵝的疾病，能導(dǎo)致鵝生產(chǎn)性能下降甚至死亡。目前，有關(guān)鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌的致病機(jī)理仍不清楚。1977 年，Chai等發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的 OmpA 蛋白是大腸桿菌外膜上的主要蛋白^[10]。1984 年 Morona等預(yù)測 OmpA 蛋白為多次跨膜結(jié)構(gòu)^[11]。1998 年 Pautsch等描述了第1個 OmpA 蛋白的晶體結(jié)構(gòu)^[12]。本研究的OmpA precursor為二維電泳差異蛋白。研究表明，大腸桿菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性并且能夠誘導(dǎo)機(jī)體脾淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)了淋巴細(xì)胞活化，在免疫反應(yīng)中具有重要作用^[13]。OmpA 普遍存在于大腸桿菌菌體外膜中，是大腸桿菌重要的毒力因子，參與大腸桿菌對宿主細(xì)胞的黏附作用與侵襲功能^[14]。本研究成功克隆了致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌的外膜蛋白A前體蛋白基因，并在原核表達(dá)載體pET-32a（+）中成功表達(dá)，同時確定了最佳表達(dá)時間、溫度及誘導(dǎo)劑IPTG的濃度。Western Blot結(jié)果表明，融合蛋白能夠與抗His標(biāo)簽蛋白單抗腹水反應(yīng)。由于本研究期望獲得可溶性表達(dá)并盡量保持蛋白原空間構(gòu)象的完整，因此只選擇細(xì)菌裂解上清進(jìn)行鎳柱純化，對于包涵體中的蛋白并未用常用的中性去垢劑例如吐溫、NP40進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純化的蛋白在透析及濃縮的過程中極易發(fā)生析出，同時凍融后極易發(fā)生降解。免疫印跡試驗(yàn)存在雜條帶，初步分析這可能是OmpA前體蛋白發(fā)生降解的原因，應(yīng)作進(jìn)一步研究。

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