鉻脅迫對(duì)煙草葉片葉綠素?zé)晒馓匦院突钚匝醮x系統(tǒng)的影響

吳敏蘭+賈洋洋+李葒葒+楊林通+王果

摘要：以福建省主栽煙草品種翠碧1號(hào)、K326和云煙87為材料，采用土培方法研究了鉻（Cr）脅迫對(duì)煙草葉綠素?zé)晒馓匦院突钚匝醮x系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明，以吸收光能為基礎(chǔ)的總性能指數(shù)PIABS呈顯著下降趨勢(shì)，Cr脅迫首先影響了PSⅡ?qū)饽艿奈蘸碗娮觽鬟f，降低PSⅡ反應(yīng)中心活性，引起了發(fā)生在從PSⅡ供體側(cè)（即OEC）到PSI末端電子受體還原整個(gè)光合電子傳遞鏈的光抑制傷害；鉻添加量為30、60、90 mg/kg時(shí)，3種煙草葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線（O-J-I-P曲線）初始值與對(duì)照相比差異不大，未出現(xiàn)明顯的K點(diǎn)；當(dāng)鉻添加量為90 mg/kg時(shí)，J-I-P段熒光值顯著下降；低Cr添加量對(duì)煙草葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性有促進(jìn)作用，高添加量則表現(xiàn)為抑制作用；煙草葉片過(guò)氧化物酶（POD）活性和丙二醛（MDA）含量隨Cr添加量的增加呈明顯上升趨勢(shì)，表明高濃度Cr脅迫對(duì)煙草葉片膜脂系統(tǒng)造成了氧化損傷，并超出了細(xì)胞內(nèi)部的活性氧清除能力。鉻對(duì)3個(gè)煙草品種的影響無(wú)顯著差異。

關(guān)鍵詞：Cr脅迫；煙草；安全生產(chǎn)；葉綠素?zé)晒馓匦裕换钚匝醮x系統(tǒng)

中圖分類號(hào)：S572.01；Q945.78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2014）08-0092-04

高等植物的光合作用常受到各種不利環(huán)境因素的影響，重金屬污染就是其中因素之一^[1]。Cr是土壤中毒性很強(qiáng)的重金屬污染物，土壤鉻污染、農(nóng)產(chǎn)品鉻超標(biāo)及其安全性問(wèn)題已受到國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注^[2]。葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)是近年來(lái)在光合作用機(jī)理研究中發(fā)展的一種新型、快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、無(wú)損傷的檢測(cè)植物光合作用生理狀況的新技術(shù)，它包含了十分豐富的光合作用過(guò)程變化的信息，被認(rèn)為植物光合作用與環(huán)境關(guān)系的內(nèi)在探針，是研究植物逆境脅迫的可靠而有效的工具^[3-5]。

煙草是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)作物之一，其商品價(jià)值主要取決于煙葉的品質(zhì)。翠碧1號(hào)、K326和云煙87為福建省烤煙主栽品種^[6]。雖然已有不少關(guān)于土壤Cr污染對(duì)植物的影響的研究^[7-9]，但關(guān)于土壤Cr污染對(duì)煙草的影響的研究較少。已有的關(guān)于煙草的研究主要涉及Cr污染對(duì)組培苗、種子的影響^[10-12]，尚未見關(guān)于土壤Cr污染對(duì)不同生長(zhǎng)期煙草生理生化的影響的研究。本試驗(yàn)研究了不同濃度Cr脅迫下3種煙草品種超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）和葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化，探討不同濃度Cr脅迫對(duì)煙草葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及活性氧代謝系統(tǒng)的影響，以期為煙草安全生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草品種為翠碧1號(hào)、K326、云煙87。

供試土壤采自閩侯縣的農(nóng)田表層。土壤基本理化性質(zhì)如下：pH值4.84，CEC值（陽(yáng)離子交換量）為12.13 cmol/kg，有機(jī)質(zhì)含量11.32 g/kg，黏粒43，35%，粉粒31.49%，沙粒25.15%。

1.2 方法

1.2.1 土培試驗(yàn)

土培試驗(yàn)在福建農(nóng)林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院盆栽房?jī)?nèi)進(jìn)行。每盆裝風(fēng)干土9 kg，一次性施入重鉻酸鉀（K2Cr2O7），各處理Cr添加濃度分別為0（CK）、30、60、90 mg/kg，每處理重復(fù)3次。同時(shí)每盆施入煙草專用肥2.94 g，鈣鎂磷肥0.70 g。煙草幼苗由福建省煙科所培育，當(dāng)幼苗生長(zhǎng)到2～3片真葉時(shí)，移栽到已裝土的塑料盆中，每盆1株。移栽后的管理同一般大田生產(chǎn)。

移栽85 d后，于2012年6月26日取樣。取中部相同葉位的葉片用面積為0.608 cm2的打孔器打孔取樣，樣品裝入錫箔袋中，密封，迅速放入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-86 ℃超低溫冷凍存儲(chǔ)箱，備用。

1.2.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

于2012年6月25日夜間，在各植株中部選取相同部位同一方向且長(zhǎng)勢(shì)相同的無(wú)病蟲害葉片，用 Handy PEA植物效率儀（英國(guó)Hansatech公司）測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。準(zhǔn)確記錄葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線的快相部分，完整測(cè)定葉綠素的O-J-I-P熒光誘導(dǎo)曲線。主要測(cè)定Fo（初始熒光）、Fm（最大熒光）、Fv、Fv/Fm（PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率）、PIABS等多個(gè)熒光參數(shù)。

1.2.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定

采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法測(cè)定。取3片小圓葉片，加入1.6 mL提取液（0.5 mol/L pH值7.8的磷酸緩沖液、0.1 mol/L EDTA、0.5% Triton），冰浴充分研磨，于4 ℃下12 000 r/min離心20 min，取上清液備用。SOD活性按Giannopolitis和Rice（1977年）的方法略作修改：反應(yīng)液為0.05 mol/L磷酸緩沖液、130 mmol/L Met溶液、750 μmol/L NBT、100 μmol/L EDTA液。?。?）上清液50 μL+3.85 mL反應(yīng)液+100 μL核黃素溶液；（2）提取液50 μL+3.85 mL反應(yīng)液+100 μL核黃素溶液；（3）上清液50 μL+3.85 mL反應(yīng)液+100 μL核黃素溶液。（1）、（2）在12 000 lx光照強(qiáng)度下反應(yīng)25 min，以（3）不照光為對(duì)照。用島津UV-1750雙光束紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定560 nm 吸光度，并計(jì)算SOD活性，以抑制NBT光化還原50%為1個(gè)酶活單位（U）。

1.2.4 過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定

采用愈創(chuàng)木酚法，酶液提液方法同SOD活性測(cè)定。反應(yīng)混合液為50 mmol/L磷酸緩沖液（pH值6.0）、50 mmol/L愈創(chuàng)木酚、2%過(guò)氧化氫、H2O混合均勻。取比色皿加入990 μL反應(yīng)混合液+10 μL酶液快速混勻，立即開啟秒表，于分光光度計(jì)470 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，3 min后再讀數(shù)1次。以1 min內(nèi)D470 nm變化0.01為1個(gè)過(guò)氧化物酶活性單位（U）。

1.2.5 丙二醇（MDA）含量測(cè)定

采用雙波長(zhǎng)硫代巴比妥酸法（TBA）法，按史樹德改進(jìn)的方法^[13]略作修改：取3片小圓葉片加入1.6 mL 5%三氯乙酸（TCA）提取液，研磨至勻漿，勻漿在4 000 r/min離心10 min。吸取離心的上清液0.8 mL，加入0.8 mL硫代巴比妥酸法（TBA）溶液，搖勻，放入沸水浴中煮沸10 min，取出并冷卻，4 000 r/min離心10 min，取上清液用島津UV-1750雙光束紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定450、532、600 nm的吸光度，并計(jì)算MDA含量（μmol/m2）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理和分析采用DPS和Sigmaplot軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤Cr對(duì)葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.1.1 Cr脅迫對(duì)葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)PIABS的影響

高等植物的光合作用是在葉綠體內(nèi)進(jìn)行的，大多數(shù)光合色素都存在于捕光天線的外圍色素蛋白（PSⅠ）之中。色素分子由于吸收光量子轉(zhuǎn)化為激態(tài)，從外圍的天線系統(tǒng)傳遞到更接近反應(yīng)中心（RC）的光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）。室溫下絕大多數(shù)葉綠素?zé)晒舛紒?lái)自PSⅡ。Fv/Fm為開放的PSⅡ反應(yīng)中心捕獲激發(fā)能的效率，F(xiàn)v/Fm的變化代表PSⅡ光化學(xué)效率的變化，而以吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)PIABS可以更為準(zhǔn)確地反映植物光合機(jī)構(gòu)的狀態(tài)^[14]，是光抑制程度的一個(gè)重要指標(biāo)，其比值越高表明光抑制的程度越低，是研究植物脅迫的重要參數(shù)。由圖1可知，隨著Cr脅迫濃度的升高，煙草PIABS呈下降趨勢(shì)。翠碧1 號(hào)CK處理葉片的PIABS為1.199 0，90 mg/kg Cr處理葉片為0.612 7，僅為對(duì)照的51.10%，顯著低于CK處理。K326對(duì)照PIABS為1.197 7，Cr添加濃度60、90 mg/kg處理葉片PIABS分別為對(duì)照的56.0%、26.38%，說(shuō)明當(dāng)土壤Cr濃度升高時(shí)，光合反應(yīng)中心的活性顯著下降。當(dāng)Cr添加濃度為 0（CK）、30 mg/kg 時(shí)，云煙87葉片的PIABS分別為1.083 3、0.925 7；當(dāng)Cr添加濃度為90 mg/kg時(shí)，葉片的PIABS已低至0.657 3，為對(duì)照的60.7%。云煙87較翠碧1號(hào)和K326下降幅度較小。上述結(jié)果表明，在Cr脅迫下，煙草葉片光合反應(yīng)中心的活性顯著下降。

2.1.2 土壤Cr對(duì)葉片葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線（O-J-I-P曲線）的影響

葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線反映了光合電子傳遞鏈的傳遞情況，有4個(gè)重要的拐點(diǎn)，即O-J-I-P拐點(diǎn)，分別為（1）O（20～50 μs），說(shuō)明植物光系統(tǒng)（PSⅠ）釋放的熒光量可以理解為PSⅠ的光合效率；（2）J（2×103 μs），指示光反應(yīng)中電子受體的氧化情況；（3）I（3×104 μs時(shí)的熒光強(qiáng)度值）；（4）P（3～105 μs），為最大熒光值。I和P階段反映光驅(qū)動(dòng)下氧化鐵還原蛋白情況^[14-15]。圖2、圖3、圖4分別為翠碧1號(hào)、K326和云煙87不同濃度Cr脅迫下O-J-I-P曲線的變化情況。Cr添加量為0 mg/kg（對(duì)照）時(shí)，為標(biāo)準(zhǔn)的葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線。由圖2可見，與對(duì)照相比，30、60、90 mg/kg 脅迫下O-J-I-P曲線形狀變化不大，尤其是起始部分的影響不大，說(shuō)明此時(shí)熒光值升高是因?yàn)殡娮觽鬟f受阻，而并非天線色素細(xì)胞或放氧復(fù)合體被破壞^[16]，這與張謐等對(duì)沙冬青的研究^[14]相類似。在Cr最高濃度90 mg/kg脅迫下，翠碧1號(hào)、K326和云煙87J-I-P段熒光值顯著下降。由此可見，在90 mg/kg濃度脅迫下，翠碧1號(hào)、K326和云煙87的光合電子傳遞鏈的傳遞已受到顯著影響。

2.2 土壤Cr脅迫對(duì)煙草葉片膜系統(tǒng)和酶活性影響

從圖5可看出，翠碧1號(hào)和云煙87經(jīng)不同濃度Cr脅迫后，低濃度Cr對(duì)煙草葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性有促進(jìn)作用，高濃度則表現(xiàn)為抑制作用。在Cr添加量為60 mg/kg時(shí)，翠碧1號(hào)SOD活性上升了6.38%（相當(dāng)于對(duì)照處理）；在Cr添加量為30 mg/kg時(shí)，云煙87 SOD活性上升了9.90%；在Cr添加量為90 mg/kg時(shí)，翠碧1號(hào)SOD活性下降了3.25%，云煙87 SOD活性下降了19.65%；而K326在不同濃度Cr脅迫下SOD活性一直呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，60、90 mg/kg脅迫下，SOD活性分別下降了27.91%、28.73%。

過(guò)氧化物酶（POD）是植物細(xì)胞中活性較高的一種酶，與光合作用、生長(zhǎng)素的氧化和呼吸作用都有關(guān)系。在Cr脅迫條件下，煙草葉片的過(guò)氧化物酶（POD）活性隨Cr添加量的增加呈明顯的上升趨勢(shì)（圖6）。在Cr添加量為30 mg/kg時(shí)，翠碧1號(hào)葉片的POD活性升高，云煙87降低，均與對(duì)照沒(méi)有顯著差別，但當(dāng)Cr添加量為60 mg/kg時(shí)，其POD活性與對(duì)照有極顯著差別（P<0.01）。當(dāng)Cr添加量為90 mg/kg時(shí)，K326葉片POD活性與對(duì)照相比上升了17.26 U/m2，但無(wú)顯著差異（P>0.05）。

供試煙草葉片丙二醛（MDA）含量隨Cr添加量的增加而升高，Cr添加量愈大升高愈快（圖7）。當(dāng)Cr添加量為 60 mg/kg 時(shí)，翠碧1號(hào)、K326和云煙87的MDA含量分別比對(duì)照上升76.07%、23.90%和89.38%；而當(dāng)Cr添加量為 90 mg/kg 時(shí)則分別上升了155.50%、89.51%和102.58%。這說(shuō)明Cr脅迫超過(guò)一定濃度后，細(xì)胞膜受到破壞，產(chǎn)生了大量的MDA，這與石貴玉等的研究結(jié)果^[10]是一致的。丙二醛（MDA）是植物受到逆境脅迫時(shí)膜脂過(guò)氧化作用的最終產(chǎn)物，其含量的高低和膜質(zhì)透性同時(shí)反映ROS對(duì)植物細(xì)胞膜傷害的程度。

3 討論

葉綠素?zé)晒馀c光合作用中各個(gè)反應(yīng)過(guò)程緊密相關(guān)，任何逆境對(duì)光合作用的影響都可通過(guò)葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化反映出來(lái)^[17-18]。本研究指標(biāo)參數(shù)Fv/Fm、PIABS和葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線均反映了植物葉片光合系統(tǒng)Ⅱ?qū)饽艿奈蘸屠们闆r。參數(shù)Fv/Fm和PIABS是光抑制程度的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，隨著Cr脅迫濃度升高，3種煙草Fv/Fm和PIABS均呈下降趨勢(shì)，煙草葉片光能吸收利用效率下降，均受到光抑制?？梢奀r脅迫首先影響了煙草葉片PSⅡ?qū)饽艿奈蘸碗娮觽鬟f，進(jìn)而降低了PSⅡ反應(yīng)中心活性，使光合機(jī)構(gòu)及活性中心受損。

葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線包含著大量關(guān)于PSⅡ供體側(cè)、受體側(cè)以及反應(yīng)中心的信息，當(dāng)PSⅡ受體側(cè)受到傷害時(shí)，熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線上300 μs處葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度就會(huì)上升，出現(xiàn)明顯的K點(diǎn)，K點(diǎn)的出現(xiàn)表明電子從PSⅡ供體側(cè)的放氧復(fù)合體（OEC）到Y(jié)z的電子傳遞受到抑制，常被用作OEC受傷害的標(biāo)志，此時(shí)O-J-I-P變?yōu)镺-K-J-I-P^[19]。本研究結(jié)果顯示，Cr脅迫對(duì)翠碧1號(hào)、K326和云煙87葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線（O-J-I-P）起始部分的影響不大，最高濃度90 mg/kg脅迫下，J-I-P段熒光值顯著下降，光合電子傳遞鏈的傳遞已受到顯著影響，PSⅡ反應(yīng)中心活性受到明顯抑制，但與CK相比均沒(méi)有明顯的K點(diǎn)出現(xiàn)，表明Cr脅迫下煙草葉片PSⅡ活性受到抑制，而供體側(cè)OEC沒(méi)有受到傷害，意味著煙草葉片OEC對(duì)Cr脅迫并不敏感，有較高的穩(wěn)定性。

植物在長(zhǎng)期的系統(tǒng)進(jìn)化過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)形成了防御活性氧、自由基毒害的保護(hù)機(jī)制。當(dāng)煙草受到Cr6+脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)啟動(dòng)了包括超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶等的保護(hù)酶系統(tǒng)^[20-21]。SOD是植物活性氧酶促清除系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，可催化超氧陰離子歧化成H2O和O2。本研究中，低濃度Cr對(duì)煙草葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性有促進(jìn)作用，高濃度則表現(xiàn)為抑制作用，呈現(xiàn)先促后抑的趨勢(shì)。低濃度Cr脅迫下，煙草體內(nèi)活性氧大量增加，導(dǎo)致酶系統(tǒng)分泌更多的酶，SOD清除超氧離子，POD清除SOD產(chǎn)生的H2O，此時(shí)SOD和 POD活性均上升，顯示出低濃度Cr脅迫對(duì)二者的促進(jìn)作用。這與宋威等對(duì)煙草種子鉻處理的結(jié)果^[12]一致。當(dāng)Cr脅迫繼續(xù)增強(qiáng)，SOD活性開始下降，說(shuō)明煙草SOD酶活性對(duì)Cr脅迫具有濃度效應(yīng)。盡管POD活性仍然保持上升趨勢(shì)，但活性氧（ROS）清除能力大大削弱，從而造成ROS積累^[19]，致使膜脂過(guò)氧化，膜透性增加，抑制植物生長(zhǎng)發(fā)育。翠碧1號(hào)、K326和云煙87在Cr脅迫下葉片中MDA含量明顯提高，說(shuō)明Cr脅迫對(duì)煙草葉片膜系統(tǒng)造成了明顯傷害，而這種傷害可能與SOD酶活性下降、ROS的積累有關(guān)，而ROS的積累可能是煙草葉片光抑制的原因^[19]。

植物的生長(zhǎng)發(fā)育離不開鉻（Cr），鉻的不足會(huì)導(dǎo)致作物生長(zhǎng)受抑制，但過(guò)量的鉻也會(huì)使作物受到毒害。一般認(rèn)為，低濃度的金屬對(duì)煙草生長(zhǎng)有利，高濃度則對(duì)煙草生長(zhǎng)有抑制作用^[22]。Parr等研究認(rèn)為，低濃度的Cr會(huì)促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)，高濃度的Cr則可抑制煙葉生長(zhǎng)^[23]。宋威等的研究也表明鉻能抑制煙草的生長(zhǎng)和光合作用^[8]。綜上所述，本研究中土壤Cr脅迫已經(jīng)對(duì)煙草翠碧1號(hào)、K326和云煙87的光系統(tǒng)電子傳遞和活性氧代謝系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p傷，從而抑制了煙草正常的生長(zhǎng)發(fā)育；鉻對(duì)3個(gè)煙草品種的影響無(wú)顯著差異。

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