陳 亮， 畢 波， 曾繼平， 楊清建， 周軼群， 楊 平， 郭 妤， 朱晶晶， 劉天一

實(shí)驗(yàn)研究

pH對(duì)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色的影響

陳 亮， 畢 波， 曾繼平， 楊清建， 周軼群， 楊 平， 郭 妤， 朱晶晶， 劉天一

目的觀察正常老化及應(yīng)激誘導(dǎo)老化(stress-induced premature senescence, SIPS)的小鼠成纖維細(xì)胞在不同pH值條件下，衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal)染色效果的變化規(guī)律。方法取新生1～3 d C57BL/6小鼠背部皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，UVB照射應(yīng)激誘導(dǎo)老化細(xì)胞，以不同代次的細(xì)胞和應(yīng)激誘導(dǎo)老化細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行衰老相關(guān)蛋白檢測(cè)，并在不同pH條件下進(jìn)行衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色，對(duì)其著色情況進(jìn)行觀察和分析。結(jié)果在P1代細(xì)胞、P6代細(xì)胞、應(yīng)激誘導(dǎo)老化細(xì)胞和P12代細(xì)胞中，p53/p21蛋白表達(dá)依次增多；正常P1代細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陰性，其余細(xì)胞組隨著pH值的由低到高(6.0～8.0)，著色情況均呈現(xiàn)由強(qiáng)到弱的變化趨勢(shì)，P6細(xì)胞、SIPS細(xì)胞、P12細(xì)胞分別在pH 7.0、7.5和8.0時(shí)陽性染色消失。結(jié)論隨著細(xì)胞衰老程度的增加，衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色將在較高pH時(shí)才會(huì)呈現(xiàn)假陰性，提示染色時(shí)安全pH范圍應(yīng)根據(jù)細(xì)胞代次而定。

細(xì)胞衰老; pH; 衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色

人口老齡化是當(dāng)前世界各國面臨的一個(gè)難題。細(xì)胞衰老作為生物衰老的基本單位，在抗衰老相關(guān)研究中的地位也與日俱增，細(xì)胞衰老的有效評(píng)估指標(biāo)也變得越來越重要[1-2]。1995年，由Gp Dimri等首次提出的衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase, SA-β-Gal)，作為一種鑒別衰老細(xì)胞的有效指標(biāo)已被廣泛應(yīng)用。在pH值為6.0時(shí)，SA-β-Gal可特異性識(shí)別體內(nèi)外的衰老細(xì)胞，并且染色的陽性率隨衰老程度的增加而升高。后續(xù)研究表明，SA-β-Gal與衰老細(xì)胞內(nèi)溶酶體的增多有關(guān)。降低pH值會(huì)增加非特異性著色，pH為4.5時(shí)所有細(xì)胞均著色[3]；但堿性條件下，SA-β-Gal特異性如何變化卻并不十分清楚。自2014年3月，筆者研究以C57BL/6小鼠不同代次的細(xì)胞和應(yīng)激誘導(dǎo)老化(stress-induced premature senescence, SIPS)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察堿性條件下SA-β-Gal染色效果的變化規(guī)律，為正確SA-β-Gal染色提供參考。

1 材料與方法

1.1 小鼠皮膚成纖維細(xì)胞的獲取 取1～3 d SPF級(jí)C57 BL/6小鼠1只，乙醚麻醉處死后，浸泡于75%乙醇中約10 min，用DMEM洗去殘留乙醇，置于培養(yǎng)皿中，分離背部皮膚，剪下皮膚組織塊約1 cm×1 cm，立即置于2%中性蛋白酶中，37 ℃恒溫消化4 h；將皮膚取出，鑷子分離表皮和真皮，將真皮剪碎后，置于0.1%膠原酶中，37 ℃恒溫?fù)u床消化2 h，至組織塊基本消失。1500 r/min離心5 min，收集沉淀，棄上清，細(xì)胞以DMEM+10% FBS制成細(xì)胞懸液，吹打均勻后以約2×105/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，于37 ℃、5% CO2、100%飽和濕度的條件下培養(yǎng)；接近80%融合時(shí)進(jìn)行傳代，比例約為1∶4。

1.2 小鼠皮膚成纖維細(xì)胞SIPS模型的建立 采用此前本研究小組確立的方法[4]。選用P2代細(xì)胞，當(dāng)融合度為50%時(shí)，移去培養(yǎng)液，覆蓋薄層PBS，打開蓋子，置于UVB燈管(Philips TL 20 W/01 RS lamp)正下方，進(jìn)行首次照射，照射劑量(使用Lutron UV light meter測(cè)量)為120 mJ/cm2。照射完畢后，吸去PBS，加入10 ml DMEM+1% FBS繼續(xù)培養(yǎng)，每隔12 h照射1次，共4次，每次照射完畢后用含1% FBS的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；末次照射完成后用DMEM+10%FBS培養(yǎng)。

1.3 衰老相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 正常細(xì)胞或SIPS細(xì)胞末次照射48 h后，移去培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS洗滌3次，培養(yǎng)皿移至冰上，加入蛋白裂解液200 μl，用1 ml針頭反復(fù)吹打，轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，冰上靜置15 min；12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，取各個(gè)處理組蛋白提取液，調(diào)整蛋白濃度，與等體積2倍上樣緩沖液混合，煮沸并離心；電泳分離蛋白并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，孵育袋中加入TEST稀釋的p53、p21( abcam 1∶500)和GAPDH (boster 1∶2000)，4 ℃孵育過夜；采用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(Jack-son 1∶2000)室溫孵育2 h；采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影和定影。

1.4 不同pH值時(shí)β-半乳糖苷酶組化檢測(cè)及陽性分析 6孔板內(nèi)生長的正常細(xì)胞或SIPS細(xì)胞PBS漂洗2次，室溫下固定5～10 min(固定液含2%多聚甲醛和0.2%戊二醛)，加入新配制的SA-β-Gal染色液(2 mmol/L MgCl2，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L K3Fe(CN)6，5 mmol/L K4Fe(CN)6，1 g/L X-Gal)，使用 HCl 或NaOH 分別調(diào)節(jié)pH為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。37 ℃無CO2孵育48 h，鏡下觀察，陽性物質(zhì)為藍(lán)色沉淀。采用Image-ProPlus圖文分析系統(tǒng)，每個(gè)pH值條件下隨機(jī)選取100細(xì)胞，測(cè)定每個(gè)細(xì)胞中陽性著色面積與該細(xì)胞總面積的百分比，取其均值作為SA-β-Gal陽性表達(dá)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白的表達(dá) 細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p53、p21作為細(xì)胞衰老的常用指標(biāo)[5]，會(huì)隨著細(xì)胞的老化而表達(dá)增加。我們從蛋白水平檢測(cè)了p53和p21的變化，發(fā)現(xiàn)與P1代的正常年輕細(xì)胞相比，P6代和P12代細(xì)胞中兩種蛋白的表達(dá)明顯增高，而UVB照射引起的SIPS老化細(xì)胞中，兩種蛋白的增加程度介于P6代和P12代細(xì)胞之間(圖1)。

2.2 SA-β-Gal組織化學(xué)檢測(cè) pH為6時(shí)，SA-β-Gal組化檢測(cè)及其陽性細(xì)胞的染色陽性面積百分顯示，與P1代年輕細(xì)胞組相比，P6、SIPS以及P12衰老細(xì)胞組中，陽性面積百分比逐漸升高，且與衰老相關(guān)周期蛋白顯示的衰老趨勢(shì)相同，分別為67%、42%和32%。但是，隨著pH值的升高，各衰老細(xì)胞組中陽性面積百分比逐漸降低(圖2)。分別在pH7.0(P6代細(xì)胞)、7.5(SIPS細(xì)胞)、8.0(P12代細(xì)胞)時(shí)，SA-β-Gal染色陰性(圖3)；且各組細(xì)胞在不同pH值時(shí)，陽性細(xì)胞的染色陽性面積百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4，P<0.05)。

3 討論

細(xì)胞衰老作為生物衰老的基本單位，在抗衰老相關(guān)研究中的地位也與日俱增，細(xì)胞衰老的有效評(píng)估指標(biāo)也變得越來越重要[2,6]。與生殖細(xì)胞、干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞所不同的是，絕大多數(shù)的正常細(xì)胞由于缺乏端粒酶而復(fù)制能力有限，最終會(huì)因端粒的逐漸侵蝕而永久性復(fù)制阻滯導(dǎo)致細(xì)胞衰老[7-8]。此外，多種其他因素如癌基因的激活、DNA的損傷、過度增生以及活性氧刺激等，也可以造成細(xì)胞的應(yīng)激性早衰[9]?，F(xiàn)在認(rèn)為，細(xì)胞衰老更是一種內(nèi)在的抑癌機(jī)制[10]。近期的衰老相關(guān)研究也表明，體內(nèi)衰老的細(xì)胞可以通過分泌多種細(xì)胞因子，蛋白酶和生長因子在組織修復(fù)、腫瘤轉(zhuǎn)歸和機(jī)體的老化等方面發(fā)揮復(fù)雜的作用[11]。因此，尋找可靠的細(xì)胞衰老生物學(xué)指標(biāo)的重要性與日俱增。

圖1 western blotting 檢測(cè)p53，p21蛋白表達(dá)圖2 應(yīng)用圖像處理工具標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)量細(xì)胞SA-β-Gal著色 a.pH為6.0時(shí)，老化細(xì)胞的SA-β-Gal染色結(jié)果 b,c.使用Image-ProPlus圖文分析系統(tǒng)對(duì)圖2a中的著色細(xì)胞進(jìn)行分析，手動(dòng)標(biāo)出細(xì)胞輪廓(2b)和著色范圍(2c)圖3 不同pH情況下，各組細(xì)胞的SA-β-Gal染色情況圖4 不同pH情況下，計(jì)算100個(gè)隨機(jī)視野下細(xì)胞著色情況以估算SA-β-Gal染色陽性面積百分比

Fig1 Expression of p53 and p21 detected by Western blotting.Fig2 Standardization assay of SA-β-Gal staining using a image processing tool. a. result of SA-β-Gal staining of MDF at pH 6.0. b. c. Image analysis of the stained cells( Figure 2a) using the Image-ProPlus and marking out the cell membrane borders (2b) and the stained area (2c) by hand.Fig3 The level of SA-β-Gal staining at different pH in the different group.Fig4 Estimation of positive area percentage of SA-β-Gal staining by analyzing random 100 cells under visual fields at different pH in the different group.

由于操作簡單和特異性明顯，SA-β-gal已廣泛應(yīng)用于體內(nèi)外衰老細(xì)胞的檢測(cè)[12-14]，甚至在某些衰老的研究中只依賴SA-β-gal一種檢測(cè)。但SA-β-gal的細(xì)胞器來源及其在衰老細(xì)胞中的作用并未完全清楚。已有報(bào)道證實(shí)，SA-β-gal是溶酶體β-gal基因GLB1的產(chǎn)物[15]。在衰老細(xì)胞中，GLB1在mRNA和蛋白的水平上都有明顯的升高，并且β-gal的活性也相應(yīng)的升高[15]。在β-gal活性最佳的pH值4.5時(shí)所有細(xì)胞染色陽性，而在β-gal次優(yōu)的pH值6.0時(shí)SA-β-gal被檢測(cè)陽性[3]。但隨著pH的升高，SA-β-gal在衰老細(xì)胞中的特異性如何變化并不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)分別選取了不同生長階段和SIPS的細(xì)胞[16]，代表年輕、正常老化和應(yīng)激老化的細(xì)胞。通過周期蛋白P53/P21來檢測(cè)評(píng)估各細(xì)胞組的老化程度，發(fā)現(xiàn)P1代、P6代、SIPS和P12代細(xì)胞衰老程度逐漸增加。隨后，在不同pH條件下(6.0～8.0)，對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行SA-β-gal檢測(cè)，并通過對(duì)其染色陽性面積百分比統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)正常年輕P1代細(xì)胞SA-β-Gal染色陰性，其余組細(xì)胞隨著pH值的由低到高(6.0～8.0)，SA-β-Gal著色情況均呈現(xiàn)由強(qiáng)到弱的變化趨勢(shì)。但各組衰老細(xì)胞并未像之前報(bào)道的在pH為7.5時(shí)染色陰性[3]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，P6代細(xì)胞、SIPS細(xì)胞、P12代細(xì)胞分別在pH 7.0、7.5和8.0時(shí),SA-β-Gal著色特異性消失。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，pH值7.5并不是SA-β-Gal染色結(jié)果陽性與陰性的分界點(diǎn)，對(duì)于衰老程度較高的細(xì)胞，pH大于7.5時(shí)SA-β-Gal染色依然存在陽性結(jié)果，而且細(xì)胞衰老程度越高，使SA-β-Gal染色達(dá)到陰性所需的pH值也越高，只要在SA-β-Gal染色陽性存在的情況下，pH大于6.0仍可以特異性的表現(xiàn)細(xì)胞相對(duì)衰老程度。這也說明衰老細(xì)胞中SA-β-Gal染色所檢測(cè)到的β-gal除與細(xì)胞中溶酶體的增多相關(guān)外，也可能受其他未知因素的影響，比如說衰老細(xì)胞中溶酶體功能的差異[15]、隨細(xì)胞衰老而最適pH不同的次級(jí)溶酶體以及溶酶體殘?bào)w的增多等[3]。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，染色陽性面積百分比與陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法相比,更能敏感、有效的反映細(xì)胞衰老情況，這不僅為細(xì)胞衰老染色及分析提供實(shí)驗(yàn)性的新手段，同時(shí)為細(xì)胞抗衰老以及年輕化的相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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EffectofpHonsenescenceassociatedβ-galactosidasestaining

CHENLiang,BIBo,ZENGJi-ping,etal.

(DepartmentofPlasticandReconstructiveSurgery,HuaDongHospital,FuDanUniversity,Shanghai200040,China)

ObjectiveTo investigate the alteration of the level of senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) in the mouse dermal fibroblasts (MDF) of replicative senescence and stressinduced premature senescence (SIPS) in different pH staining solutions.MethodsMDF were harvested from dorsal skin of newborn 1-3 d C57BL/6 mice for serial subcultivation. The SIPS cells were induced by repeated UVB irradiation. The aging process was evaluated by western blotting of p53/p21 protein and senescence-associated and β-galactosidase histochemical staining was also performed in different pH solutions. The staining results were observed and analyzed.ResultsThe expression of p53 and p21at the P1、P6、SIPS and P12 cells was increased in turn; SA-β-Gal staining was negative at P1cells. With the increasing of pH (6.0-8.0), the positive percentage of SA-β-Gal staining in the other cells decreased, the positive expression in the P6、SIPS and P12 disappeared at pH of 7.0, 7.5, and 8.0, respectively.ConclusionWith the development of cell senescence, SA-β-Gal staining would show the a false negative when the pH value increased, suggesting that the safe pH range for SA-β-Gal staining should be determined with corresponding passages taken into account.

Cell senescence; pH; Senescence-associated β-galactosidase

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272125；81301642)；上海市衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀學(xué)科帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃資助項(xiàng)目(XBR2011033)；863資助項(xiàng)目(SS2014AA020705)

200040 上海，復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院 整形外科

陳 亮(1988-)，男，山東淄博人，碩士研究生.

劉天一，200040，復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院 整形外科，電子信箱：tianyiliucn@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.12.018

R329.2

A

1673-7040(2014)12-0751-04

2014-07-10)