許松云，逄 鑫，王寶華

隨著神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域取得的重大進(jìn)展，對(duì)于周?chē)窠?jīng)缺損的修復(fù)，出現(xiàn)了許多人工神經(jīng)移植物，但離理想的修復(fù)效果尚有差距，自體神經(jīng)移植仍然是周?chē)窠?jīng)缺損修復(fù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”［1］。隨著各種新的神經(jīng)替代物大量的出現(xiàn)，對(duì)其修復(fù)神經(jīng)的效果需要有一個(gè)客觀評(píng)價(jià)。本文通過(guò)免疫熒光的方法，應(yīng)用脊髓腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)水平來(lái)評(píng)價(jià)周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)的效果。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 取健康成年SD大鼠30只，體重200～250 g。隨機(jī)分成正常組、自體神經(jīng)組和硅膠管組，每組10只。

1．2 手術(shù)方法 用 0．25%硫噴妥鈉（1 ml／100 g）腹腔注射麻醉大鼠，右股部顯露坐骨神經(jīng)，距梨狀肌下孔1 cm處切除10 mm神經(jīng)，造成神經(jīng)缺損。自體神經(jīng)組將剪斷的神經(jīng)原位縫合于神經(jīng)兩斷端間的缺損處，并注入5 mg神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。硅膠管組在造成坐骨神經(jīng)缺損10 mm后，用等長(zhǎng)的醫(yī)用硅膠管，橋接于神經(jīng)兩斷端，并注入5 mg神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。正常組不實(shí)施手術(shù)，和其他組一起飼養(yǎng)。術(shù)后各組大鼠均常規(guī)飼養(yǎng)4個(gè)月。

1．3 標(biāo)本的取材 術(shù)后4個(gè)月，給予大鼠腹腔注射0．25%硫噴妥鈉麻醉后，依次剪開(kāi)胸腔、右心房，心室，再剪開(kāi)左心室，將輸液管通過(guò)左心室插入主動(dòng)脈內(nèi)，快速灌注生理鹽水150 ml，快速灌注4%多聚甲醛 200 ml，緩慢滴注 300 ml，持續(xù) 1．5～2．0 h，進(jìn)行固定。仔細(xì)沿橫棘突打開(kāi)椎板，注意不損傷脊髓，取脊髓腰膨大段（L3～L6），浸入 20%蔗糖液，冰箱 4 ℃過(guò)夜，恒冷箱橫斷面切片。

1．4 BDNF免疫熒光染色 所有組織均置于冷凍膠中包埋，做冷凍切片厚為7 μm，染色方法如下：組織切片晾干后，放入4%多聚甲醛內(nèi)固定10 min；0．02MPBS沖洗3 min×3次；滴加山羊血清液封閉抗原20 min，甩去封閉液；分別滴加1∶150稀釋的兔抗大鼠BNDF抗體，在37℃濕盒孵育40 min；0．02MPBS 沖洗，3 min×3 次； 滴加 1∶200 紅色熒光標(biāo)記山羊抗兔單克隆抗體（IgG），37℃濕盒孵育30 min； 0．02M PBS 沖洗，3 min×3 次，封片，在熒光顯微鏡下觀察脊髓前角。

2 結(jié) 果

通過(guò)免疫熒光染色，可見(jiàn)各組脊髓前角內(nèi)均有BDNF表達(dá)，表現(xiàn)為點(diǎn)狀紅色熒光，均勻彌漫分布，膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)及周?chē)蟹植?，未染出神?jīng)元。光密度正常組＞自體神經(jīng)組＞硅膠管組。硅膠管組紅色熒光密度最低，可見(jiàn)較多黑色背景區(qū)域（圖1～3）。

圖1 正常組脊髓前角腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)（×400）

圖2 自體神經(jīng)組脊髓前角腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)（×400）

圖3 硅膠管組脊髓前角腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)（×400）

3 討 論

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子中的重要一員［2］，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，對(duì)神經(jīng)元的生存、分化、生長(zhǎng)及執(zhí)行功能起重要作用，已引起人們的重視。BDNF對(duì)正常哺乳動(dòng)物運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有廣泛的作用，其高親和性受體trkB在脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)有一定的表達(dá)。周?chē)窠?jīng)損傷后其表達(dá)明顯上調(diào)，這種上調(diào)與神經(jīng)損傷后軸突攝取與逆行轉(zhuǎn)運(yùn)BDNF明顯增加是一致的。BDNF具有引導(dǎo)軸突延伸塑形，促進(jìn)周?chē)窠?jīng)損傷后再生和髓鞘形成，還對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)起重要作用［3］。脊髓前角內(nèi)BDNF的表達(dá)水平可以反映坐骨神經(jīng)再生的質(zhì)量［4］。本研究采用免疫熒光的方法檢測(cè)脊髓前角內(nèi)BDNF水平，結(jié)果顯示脊髓內(nèi)可見(jiàn)點(diǎn)狀紅色熒光，均勻彌漫分布，膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)及周?chē)蟹植?，未染出神?jīng)元細(xì)胞，熒光密度的多少反映BDNF水平的多少。本研究正常組BDNF水平多于自體神經(jīng)組，自體神經(jīng)組多于硅膠管組，BDNF水平與坐骨神經(jīng)恢復(fù)水平呈正相關(guān)，因此可以應(yīng)用脊髓腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)水平來(lái)評(píng)價(jià)周?chē)窠?jīng)損傷恢復(fù)的情況。

［1］ Deumens R，Bozkurt A，Meek MF，et al．Repairing injuried peripheral nerves： Bridging the gap［J］．Prog Neurobiol，2010，92（3）：245－276．

［2］ Autry AE，Monteggia LM．Brain－derived neurotrophic factor and neuropsychiatric disorders ［J］．Pharmacol Rev，2012，64（3）：238－258．

［3］ Zhang HY，Jin XB，Lue TF．Three important components in the regeneration of the cavernous nerve：brain－derived neurotrophic factor，vascular endothelial growth factor and the JAK／STAT signaling pathway［J］．Asian J Androl，2011，13（2）：231－235．

［4］李昌琪，劉 丹，盧大華，等．小鼠坐骨神經(jīng)損傷后內(nèi)源性BDNF對(duì)脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)突觸素I mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)［J］．神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2005，21（4）：345－349．