金針菇原生質(zhì)體制備和再生探究

陳鵬　郭成金

摘要：采用正交試驗方法對影響金針菇[Flammulina velutipes（Curt.：Fr.）Sing.]原生質(zhì)體制備、再生的主要因素進(jìn)行探究，結(jié)果表明，金針菇原生質(zhì)體最佳再生體系為：培養(yǎng)7 d的菌絲體，在1%溶壁酶、1%蝸牛酶組成的混合酶中，以0.6 mol/L MgSO4·7H2O作為滲穩(wěn)劑，在30 ℃下酶解4 h，經(jīng)過3次驗證試驗，金針菇原生質(zhì)體再生率高達(dá)0.851 7。最佳制備體系為：培養(yǎng)9 d的菌絲體，在2%溶壁酶中，以0.6 mol/L蔗糖作為滲穩(wěn)劑，在26 ℃下酶解4 h，此條件下金針菇原生質(zhì)體的制備率高達(dá)2025×107個/mL。

關(guān)鍵詞：金針菇；正交試驗；原生質(zhì)體；再生；融合；誘變

中圖分類號： S646.1+50.36文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0200-05

收稿日期：2013-12-03

基金項目：國家星火計劃 （編號：2012GA610002）

作者簡介：陳 鵬（1989—），女，天津人，碩士研究生，主要從事蕈菌生物學(xué)研究。Tel：（022）23765561；E-mail：630261583@qq.com。

通信作者：郭成金，教授，主要從事植物細(xì)胞營養(yǎng)及蕈菌生物學(xué)研究。Tel：（022）23765561；E-mail：chengjin@vip.sina.com。金針菇[Flammulina velutipes（Curt.：Fr.）Sing.]別稱冬菇、樸菇、構(gòu)菌、青杠菌、毛柄金錢菌等，隸屬擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）傘菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）金錢菌屬（Flammulina）[1]。金針菇菌蓋滑嫩、菌柄細(xì)長脆質(zhì)、形美、味鮮，富含多種維生素、礦物質(zhì)，不含膽固醇，富含賴氨酸、精氨酸，能促進(jìn)幼兒大腦發(fā)育[2]。金針菇藥用價值很高，金針菇具有抗腫瘤、護(hù)肝作用，是世界上著名的觀賞菌、食藥兼用菌，是目前工廠化生產(chǎn)技術(shù)最成熟的菇類之一[3-4]。原生質(zhì)體指將細(xì)胞壁破除后由質(zhì)膜包裹的裸露的細(xì)胞結(jié)構(gòu)[5]。1973年，有學(xué)者將原生質(zhì)體融合技術(shù)運用到蕈菌研究領(lǐng)域。目前原生質(zhì)體融合技術(shù)已成為研究蕈菌生理、生化、遺傳等基礎(chǔ)理論、改良菌種的重要方法。有學(xué)者采用單因素試驗對金針菇原生質(zhì)體制備、再生進(jìn)行了研究，但再生率均不高[6-7]。筆者在前人的基礎(chǔ)上首次采用正交試驗方法對影響金針菇原生質(zhì)體制備、再生條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為開展金針菇原生質(zhì)體融合、誘變研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌種金針菇保藏種由天津師范大學(xué)蕈菌研究所提供。

1.1.2試劑葡萄糖、蔗糖、甘露醇、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、維生素B1、KCl、NaCl、瓊脂（天津福晨化學(xué)試劑廠）、溶壁酶（廣東省微生物研究所）、蝸牛酶、纖維素酶（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、馬鈴薯、棉籽皮、玉米粉。

1.1.3儀器與設(shè)備YXQG02手提式壓力蒸汽消毒器（山東新華醫(yī)療器械廠）、SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、WDP型微生物多用培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）、TGL-16G高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、BS224S電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、HH-S恒溫水浴鍋（江蘇省醫(yī)療儀器廠）、血球計數(shù)板（上海求精生化試劑儀器有限公司）、Galen光學(xué)顯微鏡（Gambrige公司）、針頭式濾器、0.22 μm微孔濾膜（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。

1.1.4培養(yǎng)基PDA綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯 20.00%（浸提液）、棉籽皮20.00%（浸提液）、葡萄糖 2.00%、KH2PO4 030%、MgSO4·7H2O 0.15%、維生素B1 0.0004%、瓊脂 200%，pH值自然[8]。液體培養(yǎng)基：玉米粉 3.00%（浸提液）、馬鈴薯15.00%（浸提液）、葡萄糖 0.50%、KH2PO4 002%、KH2PO4 0.08%、MgSO4·7H2O 0.05%、pH值 6.0～65。再生培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基+0.8%瓊脂，以0.6 mol/L甘露醇配得，pH值自然。再生對照培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基+08%瓊脂，以蒸餾水配得，pH值自然。滲穩(wěn)劑：甘露醇、蔗糖、KCl、NaCl 均為0.6 mol/L。

1.2方法

1.2.1菌絲體的培養(yǎng)取斜面培養(yǎng)基上經(jīng)提純復(fù)壯后生長旺盛的菌絲體尖端接種于液體培養(yǎng)基表面，25 ℃靜置培養(yǎng) 5～11 d，每隔24 h手搖1次。

1.2.2酶液的配制按表1稱取各種酶置于4 mL離心管中，用相應(yīng)滲穩(wěn)劑溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后備用。

1.2.3原生質(zhì)體的分離在無菌操作下取培養(yǎng)好的菌絲體濕質(zhì)量約500 mg置于4 mL離心管中，6 000 r/min離心 10 min，棄上清液，用相應(yīng)的滲穩(wěn)劑洗滌3次，用無菌濾紙吸去多余水分。4 mL離心管中，每100 mg濕菌絲體加1 mL酶液，每管放入2粒直徑為2.5 mm的無菌玻璃珠，在恒溫水浴鍋中進(jìn)行酶解。吸取1～10 μL酶解液，用血球計數(shù)板計算原生質(zhì)體的初步得率。

1.2.4原生質(zhì)體的純化酶解一定時間后，用孔徑為18 μm的無菌濾網(wǎng)過濾原生質(zhì)體懸液，除去殘余的菌絲體片段。濾液4 000 r/min離心10 min，棄上清液，用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌3次，得到純化的原生質(zhì)體。吸取少許懸液，置于顯微鏡下觀察，用血球計數(shù)板計算原生質(zhì)體最終得率。

1.2.5原生質(zhì)體再生將純化的原生質(zhì)體懸液稀釋至濃度為105個/mL，吸取0.2 mL涂布在再生培養(yǎng)基上，另取0.2 mL用無菌水稀釋的原生質(zhì)體懸液涂布在對照培養(yǎng)基上，作為對照。培養(yǎng)8～15 d后記錄再生菌落數(shù)，每處理重復(fù)3次，再生率計算公式如下：endprint

原生質(zhì)體再生率=（再生菌落數(shù)-對照組再生菌落數(shù)）/涂布的原生質(zhì)體總數(shù)×100%。

2結(jié)果與分析

2.1原生質(zhì)體的釋放方式

金針菇原生質(zhì)體有4種釋放方式。酶解反應(yīng)初期無原生質(zhì)體釋放，但菌絲出現(xiàn)斷裂，菌絲變粗、變短且膨大，在菌絲頂端部位細(xì)胞的細(xì)胞壁被溶解，原生質(zhì)體從細(xì)胞壁缺口溢出，原生質(zhì)體呈球形，通常金針菇菌絲以這種方式從缺口釋放1～2個原生質(zhì)體。0.5 h后，菌絲慢慢變得疏松，菌絲側(cè)面出現(xiàn)孔洞，原生質(zhì)體從側(cè)面被釋放出來。隨著酶解時間的延長，一些菌絲細(xì)胞壁橫隔被溶解，大部分菌絲裂解成菌絲段，原生質(zhì)體從菌絲段的一端或兩端釋放出來。當(dāng)酶解比較徹底時，質(zhì)壁分離，在內(nèi)外環(huán)境的壓力下，原生質(zhì)體從孔洞溢出，呈串珠排列在原位（圖1）。

2.2影響原生質(zhì)體制備的因素

由表2可知，各因素對原生質(zhì)體制備率的影響由大到小依次為：酶組成及濃度>酶解時間>滲穩(wěn)劑>菌齡>酶解溫度。最佳原生質(zhì)體制備條件組合為A2B4C1D4E3。即培養(yǎng)9 d的菌絲體，在2%溶壁酶中，以0.6 mol/L蔗糖作為滲穩(wěn)劑，在26 ℃下酶解4 h，此條件下金針菇原生質(zhì)體的制備率高達(dá)2025×107個/mL，原生質(zhì)體大小均勻、質(zhì)膜完整、平滑明亮（圖2）。

2.3影響原生質(zhì)體再生的因素

胞分裂和萌發(fā)3個相互聯(lián)系又具有一定獨立性的生理過程，是細(xì)胞自我修復(fù)的過程。它有利于克服菌種退化，保持菌種自身的優(yōu)良性狀。原生質(zhì)體制備條件直接影響原生質(zhì)體的再生能力，因此采用正交試驗對影響原生質(zhì)體制備的5個因素進(jìn)行研究。由表3可知，各因素對原生質(zhì)體再生影響程度由大到小依次是酶解時間>酶組成及濃度>滲穩(wěn)劑>酶解溫度>菌齡。最佳原生質(zhì)體制備條件組合為A3B1C3D4E2。即培養(yǎng)7 d的菌絲體，在1%溶壁酶、1%蝸牛酶組成的混合酶中，以0.6 mol/L MgSO4·7H2O作為滲穩(wěn)劑，在30 ℃下酶解4 h。經(jīng)過3次驗證試驗，金針菇原生質(zhì)體再生率高達(dá)8517%，與前人研究得到的金針菇再生率相比提高了60%[6]。

2.4滲穩(wěn)劑種類與原生質(zhì)體再生的關(guān)系

參照表3的金針菇原生質(zhì)體最佳再生條件：培養(yǎng)7 d的菌絲體，在1%溶壁酶、1%蝸牛酶組成的混合酶中，以 0.6 mol/L MgSO4·7H2O作為滲穩(wěn)劑，在30 ℃下酶解4 h，比較不同滲穩(wěn)劑對金針菇原生質(zhì)體再生率的影響。

由表4可知，以甘露醇、蔗糖作為滲穩(wěn)劑，金針菇再生率高于無機(jī)鹽類，尤其以甘露醇作為滲穩(wěn)劑時金針菇再生率最高，再生菌落長出的時間也最短；以NaCl作為滲穩(wěn)劑時，金針菇再生率最低，且再生菌落長出的時間也最長。4種不同的再生培養(yǎng)基中，原生質(zhì)體的再生率相差較大，這可能是由于滲穩(wěn)劑的種類不同導(dǎo)致原生質(zhì)體對其利用、轉(zhuǎn)化的速度也不同。不同滲穩(wěn)劑培養(yǎng)基上的菌落長勢如圖3所示。

2.5原生質(zhì)體再生情況

在最佳滲穩(wěn)劑的再生培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)4 d可以看到一個半透明的白色印記，邊緣不規(guī)則，呈輻射狀。5～7 d時，菌落的痕跡變得清晰，呈白色不規(guī)則的圓形，以再生點為中心輻射狀生長。8 d以后，菌落向四周擴(kuò)大，金針菇的氣生菌絲比較旺盛，隨著時間的推移，輻射狀愈加明顯，邊緣不規(guī)則，且開始分泌色素，中心泛黃，邊緣菌絲白色，最終再生菌落布滿整個再生培養(yǎng)基（圖4）。

3結(jié)論與討論

3.1原生質(zhì)體制備的相關(guān)因素

3.1.1酶液組成對原生質(zhì)體制備率的影響蕈菌的細(xì)胞壁較復(fù)雜，使用酶法破壁制備原生質(zhì)體時，酶很關(guān)鍵。復(fù)合酶的酶解效果較單一酶效果好。溶壁酶是一種活力很強(qiáng)的復(fù)合酶[9]。本研究表明，單獨使用溶壁酶比使用其他混合酶的效果要好，這與前人研究結(jié)果[10-12]一致。由于高濃度的酶液對原生質(zhì)體有一定的損傷作用，酶解過于徹底會影響原生質(zhì)體再生，為提高原生質(zhì)體的活力，采用較低濃度的酶液配比，結(jié)果表明，2%溶壁酶效果最好。

3.1.2滲穩(wěn)劑對原生質(zhì)體制備率的影響原生質(zhì)體制備中，滲透壓穩(wěn)定劑不僅能保護(hù)原生質(zhì)體免于因滲透壓差值過大而破裂，而且有助于酶與底物結(jié)合[13]。細(xì)胞破壁后，原生質(zhì)體表3原生質(zhì)體再生正交試驗結(jié)果與極差分析

3.1.3酶解溫度對原生質(zhì)體制備率的影響隨著溫度的增加，酶易失活，原生質(zhì)體也易破損，產(chǎn)量不再增加。25～37 ℃溫度范圍內(nèi)，酶解反應(yīng)都能進(jìn)行，但對于不同的酶體系來說，最適的酶解溫度不同[15]。本研究表明，26 ℃時金針菇原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，這與前人研究結(jié)果[6]一致。

3.1.4酶解時間對原生質(zhì)體制備率的影響本研究表明，隨著酶解時間的延長，菌絲逐漸變得疏松，開始斷裂，原生質(zhì)體制備率逐漸增加，隨著酶解時間的延長，原生質(zhì)體制備率有增加的趨勢，酶解4 h，制備率最高達(dá)2.025×107個/mL。

3.1.5菌齡對原生質(zhì)體制備率的影響菌齡是影響原生質(zhì)體釋放的重要因素，菌絲體的不同生理狀態(tài)直接影響細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)、菌絲體代謝水平。菌齡過短，酶解時原生質(zhì)體易破裂，穩(wěn)定性差[16]。以菌齡為9 d的金針菇菌絲體制備原生質(zhì)體時原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，但隨著培養(yǎng)時間的延長，原生質(zhì)體產(chǎn)量下降，可能是由于老齡化菌絲細(xì)胞壁較厚，菌絲細(xì)胞壁上容易沉積色素等次生物質(zhì)，酶的作用減弱，原生質(zhì)體產(chǎn)量減少，故最佳菌齡為9 d。

3.2再生相關(guān)因素的原生質(zhì)體

3.2.1酶液組成對原生質(zhì)體再生率的影響本研究表明，用混合酶制備出的原生質(zhì)體再生率高于用單一酶制備出的原生質(zhì)體再生率。用1%溶壁酶、1%蝸牛酶組成的混合酶制備出的原生質(zhì)體再生率最高，達(dá)0.851 7，這與之前的最佳制備酶條件不同，因為適合原生質(zhì)體制備的條件不一定適合其再生。有文獻(xiàn)報道，破壁后的適量細(xì)胞壁組分可促進(jìn)細(xì)胞壁的再生[17]。本研究表明，經(jīng)酶解后一定量的細(xì)胞殘壁可以作為合成細(xì)胞壁的“引物”，有助于細(xì)胞壁再生。endprint

3.2.2滲穩(wěn)劑對原生質(zhì)體再生率的影響滲透壓穩(wěn)定劑的主要作用是維持原生質(zhì)體內(nèi)外滲透壓的平衡[18]。無機(jī)鹽類不利于再生可能是因為鹽對細(xì)胞壁降解有促進(jìn)作用。筆者認(rèn)為，原生質(zhì)體再生體系的作用是促進(jìn)細(xì)胞壁的形成以及胞內(nèi)各細(xì)胞器、超分子復(fù)合物功能修復(fù)及均衡養(yǎng)分。原生質(zhì)體制備體系及再生體系的共性在于細(xì)胞滲透壓的穩(wěn)定。

3.2.3酶解溫度對原生質(zhì)體再生率的影響酶解溫度也影響原生質(zhì)體再生。本研究表明，金針菇原生質(zhì)體再生率隨著溫度的升高有上升的趨勢，當(dāng)溫度超過30 ℃時，再生率開始下降，高溫會損傷原生質(zhì)體活性，進(jìn)而影響其再生，所以金針菇原生質(zhì)體再生的最適溫度為30 ℃。

3.2.4酶解時間對原生質(zhì)體再生率的影響本研究表明，酶解1～2 h，原生質(zhì)體釋放不徹底，再生率較低；酶解4 h時，原生質(zhì)體釋放較完全，原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)功能也較完整，再生率最高。

3.2.5菌齡對原生質(zhì)體再生率的影響本研究表明，菌齡為7 d時，金針菇原生質(zhì)體再生率最高，小于或超過7 d菌齡，菌絲細(xì)胞或過于幼嫩或已老化均不易被酶解，原生質(zhì)體活力弱，再生率呈下降趨勢。菌齡過短的菌絲細(xì)胞經(jīng)酶解破壁形成的原生質(zhì)體，有的細(xì)胞器不完全，功能尚未完善，再生能力較低。由于處在生長對數(shù)期的細(xì)胞內(nèi)含物多、功能完善，所以原生質(zhì)體再生率高、再生時間短。菌齡過長同樣不適合再生，由于細(xì)胞壁較老，酶解困難，整個原生質(zhì)體可能從酶解所生成的小孔中流出。

4結(jié)論

本研究通過正交試驗對金針菇原生質(zhì)體制備、再生條件進(jìn)行優(yōu)化，得到金針菇原生質(zhì)體最佳再生體系為：培養(yǎng)7 d的菌絲體，在1%溶壁酶、1%蝸牛酶組成的混合酶中，以 0.6 mol/L MgSO4·7H2O作為滲穩(wěn)劑，在30 ℃下酶解4 h，經(jīng)過3次驗證試驗，金針菇原生質(zhì)體再生率高達(dá)0.851 7。最佳制備體系為：培養(yǎng)9 d的菌絲體，在2%溶壁酶中，以 0.6 mol/L 蔗糖作為滲穩(wěn)劑，在26 ℃下酶解4 h，此條件下金針菇原生質(zhì)體的制備率高達(dá)2.025×107個/mL，原生質(zhì)體大小均勻、質(zhì)膜完整、平滑明亮。

參考文獻(xiàn)：

[1]于榮利，秦旭升，宋鳳菊. 金針菇研究概況[J]. 食用菌學(xué)報，2004，11（4）：63-68.

[2]黃年來，林志彬，陳國良，等. 中國食藥用菌學(xué)[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2010：937-978.

[3]何軒輝，廖森泰，劉吉平. 金針菇的食用和藥用價值研究開發(fā)進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（3）：70-72，94.

[4]侯波，鄭淑彥，邰麗梅，等. 金針菇營養(yǎng)保健功能及食品加工研究現(xiàn)狀[J]. 食品研究與開發(fā)，2013，34（12）：122-126.

[5]Gregory D W，Cocking E C. Studies on isolated protoplasts and vacuoles：I.general properties[J]. Journal of Experimental Botany，1966，17（1）：57-67.

[6]陳力力，馬美湖，周傳云，等. 不同因素對金針菇原生質(zhì)體制備和再生的影響[J]. 生物技術(shù)，2005，15（5）：47-51.

[7]龔淑俐，鄧放明，陳力力.金針菇原生質(zhì)體制備的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技，2007，23（4）：54-57.

[8]郭成金. 蕈菌生物學(xué)[M]. 天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，2005：144-146.

[9]張麗霞，郭成金. 豬苓原生質(zhì)體制備與再生條件的研究[J]. 中國食用菌，2008，27（5）：35-37，55.

[10]張炳熾. 金針菇原生質(zhì)體制備和再生條件實驗[J]. 山東師大學(xué)報：自然科學(xué)版，1990，5（3）：74-77.

[11]Hongg S W. Formation and regeneration of protoplasm in Lentinus edodes[J]. Mushroom Newsletter for the Tropics，1988，5（4）：1-3.

[12]Cheng Y，Bélanger R R. Protoplast preparation and regeneration from spores of the biocontrol fungus Pseudozyma flocculosa[J]. FEMS Microbiology Letters，2000，190（2）：287-291.

[13]劉文芳，郭成金. 白靈菇原生質(zhì)體制備與再生研究[J]. 天津師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，32（1）：88-92.

[14]郭成金，楊子美. 槐耳原生質(zhì)體制備與再生研究[J]. 天津師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，30（4）：63-67.

[15]張志光. 真菌原生質(zhì)體技術(shù)[M]. 長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，2003：79-86.

[16]金衛(wèi)根，孫麗萍. 茶薪菇原生質(zhì)體制備條件的分析[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，21（11）：147-148，150.

[17]Fodor K，Alfldi L. Fusion of protoplasts of Bacillus megaterium[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1976，73（6）：2147-2150.

[18]江力，劉國慶，竇偉. 茶樹菇原生質(zhì)體制備及融合研究[J]. 食品科學(xué)，2008，29（9）：348-351.游玲，范玉琴，葉雷，等. 廢棄油樟葉渣栽培平菇研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：205-207.endprint

3.2.2滲穩(wěn)劑對原生質(zhì)體再生率的影響滲透壓穩(wěn)定劑的主要作用是維持原生質(zhì)體內(nèi)外滲透壓的平衡[18]。無機(jī)鹽類不利于再生可能是因為鹽對細(xì)胞壁降解有促進(jìn)作用。筆者認(rèn)為，原生質(zhì)體再生體系的作用是促進(jìn)細(xì)胞壁的形成以及胞內(nèi)各細(xì)胞器、超分子復(fù)合物功能修復(fù)及均衡養(yǎng)分。原生質(zhì)體制備體系及再生體系的共性在于細(xì)胞滲透壓的穩(wěn)定。

3.2.3酶解溫度對原生質(zhì)體再生率的影響酶解溫度也影響原生質(zhì)體再生。本研究表明，金針菇原生質(zhì)體再生率隨著溫度的升高有上升的趨勢，當(dāng)溫度超過30 ℃時，再生率開始下降，高溫會損傷原生質(zhì)體活性，進(jìn)而影響其再生，所以金針菇原生質(zhì)體再生的最適溫度為30 ℃。

3.2.4酶解時間對原生質(zhì)體再生率的影響本研究表明，酶解1～2 h，原生質(zhì)體釋放不徹底，再生率較低；酶解4 h時，原生質(zhì)體釋放較完全，原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)功能也較完整，再生率最高。

3.2.5菌齡對原生質(zhì)體再生率的影響本研究表明，菌齡為7 d時，金針菇原生質(zhì)體再生率最高，小于或超過7 d菌齡，菌絲細(xì)胞或過于幼嫩或已老化均不易被酶解，原生質(zhì)體活力弱，再生率呈下降趨勢。菌齡過短的菌絲細(xì)胞經(jīng)酶解破壁形成的原生質(zhì)體，有的細(xì)胞器不完全，功能尚未完善，再生能力較低。由于處在生長對數(shù)期的細(xì)胞內(nèi)含物多、功能完善，所以原生質(zhì)體再生率高、再生時間短。菌齡過長同樣不適合再生，由于細(xì)胞壁較老，酶解困難，整個原生質(zhì)體可能從酶解所生成的小孔中流出。

4結(jié)論

本研究通過正交試驗對金針菇原生質(zhì)體制備、再生條件進(jìn)行優(yōu)化，得到金針菇原生質(zhì)體最佳再生體系為：培養(yǎng)7 d的菌絲體，在1%溶壁酶、1%蝸牛酶組成的混合酶中，以 0.6 mol/L MgSO4·7H2O作為滲穩(wěn)劑，在30 ℃下酶解4 h，經(jīng)過3次驗證試驗，金針菇原生質(zhì)體再生率高達(dá)0.851 7。最佳制備體系為：培養(yǎng)9 d的菌絲體，在2%溶壁酶中，以 0.6 mol/L 蔗糖作為滲穩(wěn)劑，在26 ℃下酶解4 h，此條件下金針菇原生質(zhì)體的制備率高達(dá)2.025×107個/mL，原生質(zhì)體大小均勻、質(zhì)膜完整、平滑明亮。

參考文獻(xiàn)：

[1]于榮利，秦旭升，宋鳳菊. 金針菇研究概況[J]. 食用菌學(xué)報，2004，11（4）：63-68.

[2]黃年來，林志彬，陳國良，等. 中國食藥用菌學(xué)[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2010：937-978.

[3]何軒輝，廖森泰，劉吉平. 金針菇的食用和藥用價值研究開發(fā)進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（3）：70-72，94.

[4]侯波，鄭淑彥，邰麗梅，等. 金針菇營養(yǎng)保健功能及食品加工研究現(xiàn)狀[J]. 食品研究與開發(fā)，2013，34（12）：122-126.

[5]Gregory D W，Cocking E C. Studies on isolated protoplasts and vacuoles：I.general properties[J]. Journal of Experimental Botany，1966，17（1）：57-67.

[6]陳力力，馬美湖，周傳云，等. 不同因素對金針菇原生質(zhì)體制備和再生的影響[J]. 生物技術(shù)，2005，15（5）：47-51.

[7]龔淑俐，鄧放明，陳力力.金針菇原生質(zhì)體制備的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技，2007，23（4）：54-57.

[8]郭成金. 蕈菌生物學(xué)[M]. 天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，2005：144-146.

[9]張麗霞，郭成金. 豬苓原生質(zhì)體制備與再生條件的研究[J]. 中國食用菌，2008，27（5）：35-37，55.

[10]張炳熾. 金針菇原生質(zhì)體制備和再生條件實驗[J]. 山東師大學(xué)報：自然科學(xué)版，1990，5（3）：74-77.

[11]Hongg S W. Formation and regeneration of protoplasm in Lentinus edodes[J]. Mushroom Newsletter for the Tropics，1988，5（4）：1-3.

[12]Cheng Y，Bélanger R R. Protoplast preparation and regeneration from spores of the biocontrol fungus Pseudozyma flocculosa[J]. FEMS Microbiology Letters，2000，190（2）：287-291.

[13]劉文芳，郭成金. 白靈菇原生質(zhì)體制備與再生研究[J]. 天津師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，32（1）：88-92.

[14]郭成金，楊子美. 槐耳原生質(zhì)體制備與再生研究[J]. 天津師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，30（4）：63-67.

[15]張志光. 真菌原生質(zhì)體技術(shù)[M]. 長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，2003：79-86.

[16]金衛(wèi)根，孫麗萍. 茶薪菇原生質(zhì)體制備條件的分析[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，21（11）：147-148，150.

[17]Fodor K，Alfldi L. Fusion of protoplasts of Bacillus megaterium[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1976，73（6）：2147-2150.

[18]江力，劉國慶，竇偉. 茶樹菇原生質(zhì)體制備及融合研究[J]. 食品科學(xué)，2008，29（9）：348-351.游玲，范玉琴，葉雷，等. 廢棄油樟葉渣栽培平菇研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：205-207.endprint

3.2.2滲穩(wěn)劑對原生質(zhì)體再生率的影響滲透壓穩(wěn)定劑的主要作用是維持原生質(zhì)體內(nèi)外滲透壓的平衡[18]。無機(jī)鹽類不利于再生可能是因為鹽對細(xì)胞壁降解有促進(jìn)作用。筆者認(rèn)為，原生質(zhì)體再生體系的作用是促進(jìn)細(xì)胞壁的形成以及胞內(nèi)各細(xì)胞器、超分子復(fù)合物功能修復(fù)及均衡養(yǎng)分。原生質(zhì)體制備體系及再生體系的共性在于細(xì)胞滲透壓的穩(wěn)定。

3.2.3酶解溫度對原生質(zhì)體再生率的影響酶解溫度也影響原生質(zhì)體再生。本研究表明，金針菇原生質(zhì)體再生率隨著溫度的升高有上升的趨勢，當(dāng)溫度超過30 ℃時，再生率開始下降，高溫會損傷原生質(zhì)體活性，進(jìn)而影響其再生，所以金針菇原生質(zhì)體再生的最適溫度為30 ℃。

3.2.4酶解時間對原生質(zhì)體再生率的影響本研究表明，酶解1～2 h，原生質(zhì)體釋放不徹底，再生率較低；酶解4 h時，原生質(zhì)體釋放較完全，原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)功能也較完整，再生率最高。

3.2.5菌齡對原生質(zhì)體再生率的影響本研究表明，菌齡為7 d時，金針菇原生質(zhì)體再生率最高，小于或超過7 d菌齡，菌絲細(xì)胞或過于幼嫩或已老化均不易被酶解，原生質(zhì)體活力弱，再生率呈下降趨勢。菌齡過短的菌絲細(xì)胞經(jīng)酶解破壁形成的原生質(zhì)體，有的細(xì)胞器不完全，功能尚未完善，再生能力較低。由于處在生長對數(shù)期的細(xì)胞內(nèi)含物多、功能完善，所以原生質(zhì)體再生率高、再生時間短。菌齡過長同樣不適合再生，由于細(xì)胞壁較老，酶解困難，整個原生質(zhì)體可能從酶解所生成的小孔中流出。

4結(jié)論

本研究通過正交試驗對金針菇原生質(zhì)體制備、再生條件進(jìn)行優(yōu)化，得到金針菇原生質(zhì)體最佳再生體系為：培養(yǎng)7 d的菌絲體，在1%溶壁酶、1%蝸牛酶組成的混合酶中，以 0.6 mol/L MgSO4·7H2O作為滲穩(wěn)劑，在30 ℃下酶解4 h，經(jīng)過3次驗證試驗，金針菇原生質(zhì)體再生率高達(dá)0.851 7。最佳制備體系為：培養(yǎng)9 d的菌絲體，在2%溶壁酶中，以 0.6 mol/L 蔗糖作為滲穩(wěn)劑，在26 ℃下酶解4 h，此條件下金針菇原生質(zhì)體的制備率高達(dá)2.025×107個/mL，原生質(zhì)體大小均勻、質(zhì)膜完整、平滑明亮。

參考文獻(xiàn)：

[1]于榮利，秦旭升，宋鳳菊. 金針菇研究概況[J]. 食用菌學(xué)報，2004，11（4）：63-68.

[2]黃年來，林志彬，陳國良，等. 中國食藥用菌學(xué)[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2010：937-978.

[3]何軒輝，廖森泰，劉吉平. 金針菇的食用和藥用價值研究開發(fā)進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（3）：70-72，94.

[4]侯波，鄭淑彥，邰麗梅，等. 金針菇營養(yǎng)保健功能及食品加工研究現(xiàn)狀[J]. 食品研究與開發(fā)，2013，34（12）：122-126.

[5]Gregory D W，Cocking E C. Studies on isolated protoplasts and vacuoles：I.general properties[J]. Journal of Experimental Botany，1966，17（1）：57-67.

[6]陳力力，馬美湖，周傳云，等. 不同因素對金針菇原生質(zhì)體制備和再生的影響[J]. 生物技術(shù)，2005，15（5）：47-51.

[7]龔淑俐，鄧放明，陳力力.金針菇原生質(zhì)體制備的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技，2007，23（4）：54-57.

[8]郭成金. 蕈菌生物學(xué)[M]. 天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，2005：144-146.

[9]張麗霞，郭成金. 豬苓原生質(zhì)體制備與再生條件的研究[J]. 中國食用菌，2008，27（5）：35-37，55.

[10]張炳熾. 金針菇原生質(zhì)體制備和再生條件實驗[J]. 山東師大學(xué)報：自然科學(xué)版，1990，5（3）：74-77.

[11]Hongg S W. Formation and regeneration of protoplasm in Lentinus edodes[J]. Mushroom Newsletter for the Tropics，1988，5（4）：1-3.

[12]Cheng Y，Bélanger R R. Protoplast preparation and regeneration from spores of the biocontrol fungus Pseudozyma flocculosa[J]. FEMS Microbiology Letters，2000，190（2）：287-291.

[13]劉文芳，郭成金. 白靈菇原生質(zhì)體制備與再生研究[J]. 天津師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，32（1）：88-92.

[14]郭成金，楊子美. 槐耳原生質(zhì)體制備與再生研究[J]. 天津師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，30（4）：63-67.

[15]張志光. 真菌原生質(zhì)體技術(shù)[M]. 長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，2003：79-86.

[16]金衛(wèi)根，孫麗萍. 茶薪菇原生質(zhì)體制備條件的分析[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，21（11）：147-148，150.

[17]Fodor K，Alfldi L. Fusion of protoplasts of Bacillus megaterium[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1976，73（6）：2147-2150.

[18]江力，劉國慶，竇偉. 茶樹菇原生質(zhì)體制備及融合研究[J]. 食品科學(xué)，2008，29（9）：348-351.游玲，范玉琴，葉雷，等. 廢棄油樟葉渣栽培平菇研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：205-207.endprint