楊 波，梁清華*，熊新貴，陳 疆，蕭梅芳

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，湖南 長(zhǎng)沙410008；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院遠(yuǎn)程醫(yī)療中心，湖南 長(zhǎng)沙410008；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院健康管理中心，湖南 長(zhǎng)沙410008）

高血壓病腦出血是臨床常見(jiàn)急癥， 病殘率及病死率均較高。 腦出血屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)病”的范疇，肝陽(yáng)化風(fēng)證多見(jiàn)于中風(fēng)病的急性期， 陰虛風(fēng)動(dòng)證多見(jiàn)于中風(fēng)病恢復(fù)期或后遺癥期[1]。 課題組前期運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)高血壓腦出血肝陽(yáng)上亢證、 肝陽(yáng)化風(fēng)證血清[2]與外周血單個(gè)核細(xì)胞[3]進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)高血壓病肝陽(yáng)上亢證與肝陽(yáng)化風(fēng)證具有相同和差異表達(dá)的蛋白質(zhì)， 提示高血壓病肝陽(yáng)上亢證和肝陽(yáng)化風(fēng)證有共同的物質(zhì)基礎(chǔ)和不同的本質(zhì)內(nèi)涵。 我們運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法動(dòng)態(tài)觀察高血壓腦出血患者急性期肝陽(yáng)化風(fēng)證、 恢復(fù)期陰虛風(fēng)動(dòng)證外周血單個(gè)核細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)變化， 以期從蛋白質(zhì)組學(xué)角度進(jìn)一步探討“肝陽(yáng)化風(fēng)證”的本質(zhì)內(nèi)涵。

1 臨床資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《中國(guó)腦血管病防治指南（2005年）》(制定的腦出血診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，分期標(biāo)準(zhǔn)符合2000年全國(guó)腦血管專(zhuān)題研討會(huì)對(duì)腦卒中的分期標(biāo)準(zhǔn)[5]，均經(jīng)過(guò)顱腦CT 證實(shí)為腦實(shí)質(zhì)出血(出血部位為基底節(jié)，出血量為30 mL 以?xún)?nèi))，基礎(chǔ)病為高血壓病(高血壓3 級(jí))所致腦出血。 肝陽(yáng)化風(fēng)證、陰虛風(fēng)動(dòng)證辨證標(biāo)準(zhǔn)參考《中醫(yī)肝臟象現(xiàn)代研究與臨床》[6]，經(jīng)兩位以上高級(jí)職稱(chēng)醫(yī)師辨證評(píng)分。

1.1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合西醫(yī)疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)、中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)及主癥辨證5 級(jí)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)；(2)征得患者家屬同意；(3)經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；(4)年齡19～69 歲。 排除標(biāo)準(zhǔn)：排除小腦、腦干出血，腦外傷致出血，使用抗凝劑致腦出血，腫瘤/腦血管畸形致腦出血， 混合性中風(fēng)或出血性梗死，合并嚴(yán)重心、肝、腎功能不全、糖尿病、嚴(yán)重感染者[7]。

1.1.3 一般資料 10 例高血壓病腦出血患者來(lái)自2009年6月～2009年10月中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院病人，其中男8 例，女2 例，年齡45～67 歲。起病3 d 內(nèi)辨證為肝陽(yáng)化風(fēng)證（簡(jiǎn)稱(chēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證組），追蹤觀察發(fā)病后3月內(nèi)辨證為陰虛風(fēng)動(dòng)證（簡(jiǎn)稱(chēng)陰虛風(fēng)動(dòng)證組）。全部患者入院后予降低顱內(nèi)壓、降血壓（有效控制血壓140/90 mm Hg）、控制血糖、護(hù)腦、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、預(yù)防感染及應(yīng)激性潰瘍等相關(guān)內(nèi)科保守治療，全部病人未給予相關(guān)證型的中藥處方口服。 另設(shè)10 例健康志愿者（簡(jiǎn)稱(chēng)健康對(duì)照組），來(lái)自湘雅醫(yī)院健康管理中心，經(jīng)體檢符合老齡健康人條件者(參照1982年2月中華醫(yī)學(xué)老年醫(yī)學(xué)會(huì)規(guī)定)，男性7 例，女性3 例，年齡44～68 歲，其年齡、性別均與病例組相匹配(P＞0.05)，排除心、肝、腎等功能不全者，有活動(dòng)性胃腸病變者，血液、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者及過(guò)敏體質(zhì)者。

1.2 主要試劑[6]

固相pH 梯度干膠條、IPG 緩沖液、 兩性電解質(zhì)、覆蓋液、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、尿素、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、 甘氨酸、Tris、CHAPS、SDS、Amersham 2-D QuantKit 均為Amersham Bioscieces 公司產(chǎn)品；二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺、雙向凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、碳酸氫銨、三氟乙酸、乙腈、基質(zhì)a-氰基-4-羥基肉桂酸、TEMED 均為Sigma 公司產(chǎn)品， 考馬斯亮藍(lán)G-250 為USB 公司產(chǎn)品；Trizol 為Invitrogen公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)均在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院衛(wèi)生部腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3.1 淋巴細(xì)胞分離 高血壓腦出血患者于起病3 d （辨證為肝陽(yáng)化風(fēng)證） 與追蹤觀察發(fā)病后3月（辨證為陰虛風(fēng)動(dòng)證）分別抽取靜脈血，同時(shí)抽取對(duì)照組靜脈血，參照文獻(xiàn)[8]方法分離外周血淋巴細(xì)胞而獲得單個(gè)核細(xì)胞，于-70 ℃低溫凍干保存。

1.3.2 蛋白質(zhì)提取及濃度測(cè)定 參考文獻(xiàn)[3]方法稱(chēng)50～60 mg 淋巴細(xì)胞加入80 μL 細(xì)胞裂解液，混合液氮反復(fù)研磨， 震蕩使之充分溶解， 渦旋混勻，12 000 r/min 4 ℃離心1 h，取上清液即為細(xì)胞總蛋白質(zhì)。用bradford 法BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度[9]，其余上清液分裝置-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 雙向凝膠電泳（2-DE）[10]固相pH 梯度雙向凝膠電泳： 主要按IPGphor 等電聚焦系統(tǒng)指南進(jìn)行(IPGphor 等 電 聚 焦 儀，Amersham Pharmacia 公 司)。各組上樣量均為1 mg。所得凝膠用考馬斯亮藍(lán)法染色，加入脫色液(20%乙醇)至背景完全脫色。

1.3.4 凝膠圖像分析 用Imagescanner 掃描儀(Bio-Rad 公司)掃描考染的凝膠，采用PDQuest 8.0軟件(Bio-Rad 公司)進(jìn)行詳細(xì)分析，比較蛋白斑點(diǎn)的差異[11]。差異點(diǎn)的判斷有兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：一是有和無(wú)的差別，二是灰度值差異比率小于0.5 或大于200%為差異點(diǎn)，差異蛋白至少出現(xiàn)在3 次不同的實(shí)驗(yàn)中。

1.3.5 差異表達(dá)蛋白的質(zhì)譜分析 切下差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，進(jìn)行脫色，膠內(nèi)酶解，測(cè)定肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)，將PMF 用Mascot Distiller 軟件(Matrix science)識(shí)別單同位素峰，獲得的肽端的質(zhì)荷比(m/z)數(shù) 值 輸 入Mascot 軟 件(Matrixscience，www.matrixscience.com) 檢索NCBI、SwissProt 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白鑒定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腦出血肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證外周血單個(gè)核細(xì)胞差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的比較

高血壓腦出血急性期肝陽(yáng)化風(fēng)證與恢復(fù)期陰虛風(fēng)動(dòng)證患者分別取靜脈血提取單個(gè)核細(xì)胞總蛋白，與健康人比較，進(jìn)行雙向凝膠電泳，每組檢測(cè)3次，重復(fù)性好，獲得比較清晰的雙向電泳圖譜，結(jié)果如圖1 所示，見(jiàn)封三彩圖。應(yīng)用PDQuest 8.0 軟件進(jìn)行分析，檢測(cè)到肝陽(yáng)化風(fēng)證組與陰虛風(fēng)動(dòng)證組之間存在3個(gè)差異表達(dá)蛋白，提示這三個(gè)蛋白可能與腦出血不同時(shí)期證型變化有關(guān)。

2.2 腦出血肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證外周血單個(gè)核細(xì)胞差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定

對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行MALDI-TOF-MS 質(zhì)譜分析， 通過(guò)Mascot 軟件檢索NCBI、SwissProt 數(shù)據(jù)庫(kù)，初步鑒定了這3個(gè)蛋白，分別為肌動(dòng)蛋白、假想蛋白片段、纖維蛋白原α 鏈前體。 其中肌動(dòng)蛋白在腦出血肝陽(yáng)化風(fēng)證組、陰虛風(fēng)動(dòng)證組均較對(duì)照組表達(dá)下調(diào)，而在陰虛風(fēng)動(dòng)證組又較肝陽(yáng)化風(fēng)證組表達(dá)下調(diào)；纖維蛋白原α 鏈前體在腦出血肝陽(yáng)化風(fēng)證組表達(dá)上調(diào)，在陰虛風(fēng)動(dòng)證組表達(dá)下調(diào)。 表明這兩個(gè)差異蛋白可能與腦出血肝陽(yáng)化風(fēng)證、陰虛風(fēng)證動(dòng)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。 假想蛋白在肝陽(yáng)化風(fēng)證組表達(dá)缺失，在陰虛風(fēng)動(dòng)證組表達(dá)上調(diào)，提示假想蛋白可能與陰虛風(fēng)動(dòng)證發(fā)展有關(guān)。 各差異蛋白在各組的表達(dá)變化趨勢(shì)見(jiàn)表1。

表1 高血壓腦出血患者肝陽(yáng)化風(fēng)證組、陰虛風(fēng)動(dòng)證組及健康對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞差異蛋白質(zhì)表達(dá)鑒定

3 討論

課題組前期以肝陽(yáng)化風(fēng)證為中心， 從同病異證、異病同證、相關(guān)證、同類(lèi)證等角度闡述了肝陽(yáng)化風(fēng)證蛋白質(zhì)表達(dá)的關(guān)聯(lián)性與差異性及肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)3個(gè)亞型相同表達(dá)的蛋白，初步獲得了肝陽(yáng)化風(fēng)證蛋白質(zhì)的表達(dá)譜及功能，為證本質(zhì)的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)[11]。本實(shí)驗(yàn)采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法，病證結(jié)合， 動(dòng)態(tài)研究同一患者腦出血急性期肝陽(yáng)化風(fēng)證、恢復(fù)期陰虛風(fēng)動(dòng)證的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，是從另一角度排除“?。ǜ哐獕耗X出血）”的干擾，更好地進(jìn)行證（肝陽(yáng)化風(fēng)證、陰虛風(fēng)動(dòng)證）本質(zhì)內(nèi)涵的研究。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高血壓腦出血患者，急性期肝陽(yáng)化風(fēng)證與恢復(fù)期陰虛風(fēng)動(dòng)證分別抽取靜脈血提取單個(gè)核細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行雙向凝膠電泳，獲得了比較清晰的雙向電泳圖譜，采用PDQuest 分析并經(jīng)質(zhì)譜初步鑒定，腦出血急性期肝陽(yáng)化風(fēng)證與恢復(fù)期陰虛風(fēng)動(dòng)證之間存在3個(gè)差異蛋白，其中肌動(dòng)蛋白與纖維蛋白原α 鏈前體兩個(gè)蛋白可能與腦出血肝陽(yáng)化風(fēng)證、 陰虛風(fēng)動(dòng)證的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，再一次表明中醫(yī)證有其相對(duì)獨(dú)特的物質(zhì)基礎(chǔ)。

研究表明腦出血急性期存在血小板活化現(xiàn)象， 活化的血小板可能參與了血腫周?chē)X水腫的形成[12]。 血小板活化的分子基礎(chǔ)是細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白的變化，肌動(dòng)蛋白是細(xì)胞骨架的組成部分，本研究發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白在腦出血肝陽(yáng)化風(fēng)證、陰虛風(fēng)動(dòng)證下調(diào)，且陰虛風(fēng)動(dòng)證較肝陽(yáng)化風(fēng)證下調(diào)更明顯，從另一方面提示肌動(dòng)蛋白表達(dá)水平可能和血小板的早期活化有關(guān)。

纖維蛋白原 （fibrinogen，F(xiàn)ib） 是纖維蛋白的前體，由兩對(duì)α 鏈、β 鏈及γ 鏈組成，既是急性時(shí)相蛋白參與炎癥反應(yīng)，又作為體內(nèi)重要的凝血物質(zhì)參與凝血過(guò)程，在動(dòng)脈粥樣硬化及生理止血中發(fā)揮重要作用[13]。 研究表明Fib 與出血性腦卒中尤其是顱內(nèi)分支小動(dòng)脈硬化后所致腦實(shí)質(zhì)出血呈正相關(guān)[14]。 本研究發(fā)現(xiàn)腦出血急性期肝陽(yáng)化風(fēng)證組Fib 水平較健康對(duì)照組明顯升高，差異有顯著性（P＜0.05），恢復(fù)期陰虛風(fēng)動(dòng)證較健康對(duì)照組下降， 差異具有顯著性（P＜0.05）， 提示高Fib 水平與腦出血密切相關(guān)，且Fib 水平可能與出血性中風(fēng)的病程有關(guān)。 因此推測(cè)Fib 可作為腦出血急性期肝陽(yáng)化風(fēng)證、 恢復(fù)期陰虛風(fēng)動(dòng)證的特異性蛋白。

腦血管病的發(fā)病基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化。 腦出血急性期肝陽(yáng)化風(fēng)證為肝陽(yáng)亢逆無(wú)制而表現(xiàn)動(dòng)風(fēng)的證候， 可能與細(xì)胞炎癥介質(zhì)反應(yīng)強(qiáng)烈緊密關(guān)聯(lián)，其中與炎性介質(zhì)反應(yīng)引起C 反應(yīng)蛋白高水平表達(dá)、血管細(xì)胞黏附分子參與啟動(dòng)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊有關(guān)聯(lián)；陰虛風(fēng)動(dòng)證是陰液虧虛、筋脈失于濡養(yǎng)引動(dòng)肝風(fēng)的證候，多為疾病恢復(fù)期，病情相對(duì)穩(wěn)定，炎性介質(zhì)反應(yīng)不強(qiáng)，故指標(biāo)顯示的異常變化較小。

肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證屬于高血壓腦出血同一患者， 兩者必定存在著某些相同的物質(zhì)基礎(chǔ)，但由于處在不同的病變階段(有證的不同)表現(xiàn)為不同的證候，這些不同的證候是由不同的蛋白質(zhì)功能來(lái)體現(xiàn)的，由此可見(jiàn)，證與病有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)，但更重要的是證本身具有物質(zhì)基礎(chǔ)(差異的蛋白質(zhì)表達(dá))，為進(jìn)一步尋找證的本質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。 然而由于病證的相對(duì)復(fù)雜性，臨床獲取樣本量較少，盡管通過(guò)質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)，所獲得的也只是部分蛋白質(zhì)粗略的功能信息，因此，仍需要進(jìn)一步擴(kuò)大臨床樣本量，進(jìn)一步探討差異蛋白質(zhì)的功能研究及相關(guān)驗(yàn)證工作。

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