劉小瑗，范金茹*，王美香，陳學(xué)娟，熊 杜，王建湘

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生教育學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410007）

動(dòng)脈粥樣硬化（Arteriosclerosis，AS）是冠心病與頸動(dòng)脈斑塊的共同生理病理基礎(chǔ)，通過(guò)頸動(dòng)脈斑塊的形態(tài)及面積的檢測(cè)，可以預(yù)測(cè)冠脈病變及心血管事件的發(fā)生。本研究通過(guò)檢測(cè)血小板-白細(xì)胞（PLTWBC）相關(guān)參數(shù)，探討其在冠心病合并頸動(dòng)脈斑塊痰瘀互結(jié)氣郁證發(fā)病中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2013年6月至2014年5月于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科病房、心血管門診就診的冠心病合并頸動(dòng)脈斑塊患者90 例， 按照中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)分別納入痰瘀互結(jié)氣郁證組 （觀察組）60例、非痰瘀互結(jié)氣郁證組（對(duì)照組）30 例，體檢科健康成年人30 例納入健康組。 3 組的年齡、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見(jiàn)表1。

表1 3 組患者一般資料比較

1.2 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照《慢性穩(wěn)定性心絞痛診斷與治療指南》[1]及《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)—冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病診斷標(biāo)準(zhǔn)》[2]， 加拿大心臟病學(xué)會(huì)（CCS）心絞痛分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[1]，頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度（IMT）以最厚頸總動(dòng)脈IMT 為比較變量，將IMT≥1.2 mm定義為粥樣硬化斑塊形成[3-4]。

1.3 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 胸痹心痛合并眩暈診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《實(shí)用中醫(yī)心病學(xué)》[5]及《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[6]相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照 《實(shí)用中醫(yī)心病學(xué)》[5]及《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[6]，胸痹心痛分為：心血瘀阻型、氣虛血瘀型、氣滯血瘀型、痰阻心脈型、陰寒凝滯型、氣陰兩虛型、心腎陰虛型、陽(yáng)氣虛衰型。 以上8個(gè)證型凡具有胸痛、胸悶主癥之一，其他癥具有2 項(xiàng)及舌脈支持者，即可診斷。 （1）主癥：①胸痛、胸悶—胸部刺痛、脹痛或絞痛，固定不移，入夜更甚，或痛引肩背或臂內(nèi)側(cè)，胸脅脹悶或胸悶如窒而痛； ②頭暈?zāi)垦＃?③氣滯—胸脅不舒，時(shí)輕時(shí)重，常隨情志改變，情緒不寧，善太息；④多痰表現(xiàn)：口吐痰涎，咽中痰阻，體胖、肢體困重、體質(zhì)量指數(shù)＞25。 （2）次癥：①口唇紫紺，舌質(zhì)紫暗或見(jiàn)瘀斑瘀點(diǎn)，苔膩或滑，舌下系帶迂、紫暗或有瘀點(diǎn)瘀斑； ②心悸不寧；③活動(dòng)后氣促；④失眠健忘；⑤脈細(xì)澀或滑或弦。 具備主癥①、②、④項(xiàng)及以上，次癥具有⑤項(xiàng)及其他任何兩項(xiàng)以上，可診斷為痰瘀互結(jié)氣郁證。

1.4 納入標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 患者標(biāo)準(zhǔn) 符合中、西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)定型心絞痛Ⅲ級(jí)合并頸動(dòng)脈斑塊患者，年齡在40～75 歲之間。

1.4.2 健康人標(biāo)準(zhǔn) （1）60 歲以上入選者參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)老年醫(yī)學(xué)分會(huì)2013 提出的《中國(guó)健康老年人標(biāo)準(zhǔn)》[7]，60 歲以下入選者參照世界衛(wèi)生組織1989年對(duì)健康作出的定義；（2）無(wú)已有文獻(xiàn)報(bào)道的可對(duì)P-選擇素（PS）等指標(biāo)表達(dá)有影響的疾?。唬?）年齡40～75歲。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1 酶聯(lián)免疫吸附法 所有入選病例，于清晨空腹抽取靜脈血4 mL 于抗凝管中， 以3 000 r/min的速度離心15 min。 取上清液，于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?嚴(yán)格按照試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號(hào)：201402）說(shuō)明書(shū)要求操作，檢測(cè)血漿P 選擇素（PS）、P 選擇素糖蛋白配體-1(PSGL-1)、WBC 分化抗原40(CD40)、WBC 分化抗原40配體(CD40L)水平。

1.5.2 流式細(xì)胞術(shù) 所有入選病例， 于清晨空腹抽取靜脈血4 mL 于抗凝管中， 分別取兩支空白流式管， 標(biāo)記為管①及管②， 在兩支流式管中分別加入10 mL 全血。于管①中加入2 μL CD45、4 μL CD40、4 μL CD162 及4 μL CD154； 于管②中加入2 μL CD45、4 μL CD40、4 μL CD62P、4 μL CD41a 及4 μL CD154。 避光孵育20～30 min 后分別在兩管中加入BPS 緩沖液300 μL，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。所有流式細(xì)胞術(shù)試劑均采用美國(guó)BD 公司生產(chǎn)的試劑。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。 計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用卡方檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)；計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，以“±s”表示， t檢驗(yàn)，不滿足正態(tài)性分布及方差齊性者采用非參數(shù)檢驗(yàn)。 所有數(shù)據(jù)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組患者血漿PS、PSGL-1、CD40、CD40L 比較

觀察組、對(duì)照組血漿PS、PSGL-1、CD40、CD40L水平均明顯高于健康組（P＜0.01），且觀察組高于對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 3 組患者血漿PS、PSGL-1、CD40、CD40L 比較 （±s）

表2 3 組患者血漿PS、PSGL-1、CD40、CD40L 比較 （±s）

注：與健康組比較**P＜0.01；與對(duì)照組比較##P＜0.01。

組 別觀察組對(duì)照組健康組n 60 30 30 PS(ng/L)30.28±6.11**##22.47±7.39**7.83±3.39 PSGL-1(pg/mL) CD40(ng/L) CD40L(ng/L)3 013.54±320.72**## 68.58±6.13**## 713.71±65.86**##2 671.14±294.05** 53.93±4.19** 651.54±58.21**1 231.38±142.83 35.79±3.88 375.15±28.59

2.2 3 組患者血細(xì)胞PS、PSGL-1、CD40、CD40L 比較

觀察組、 對(duì)照組血細(xì)胞PS、PSGL-1 水平及WBC、PLT 上CD40、CD40L 水平均明顯高于健康組（P＜0.01），且觀察組高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 3 組患者血細(xì)胞PS、PSGL-1、CD40、CD40L 比較 （±s，%）

表3 3 組患者血細(xì)胞PS、PSGL-1、CD40、CD40L 比較 （±s，%）

注：與健康組比較**P＜0.01；與對(duì)照組比較#P＜0.05。

組 別觀察組對(duì)照組健康組n 60 30 30 PS 41.78±15.32**#28.25±13.01**3.68±1.42 CD40 CD40L WBC PLT WBC PLT 87.36±5.39**# 1.46±0.51**# 2.39±0.48**# 1.38±0.45**# 1.05±0.62**#72.75±3.53** 1.15±0.42** 1.94±0.62** 1.02±0.39** 0.81±0.49**64.75±3.53 0.20±0.19 0.32±0.11 0.23±0.28 0.10±0.04 PSGL-1

3 討論

PLT-WBC 相互反應(yīng)主要涉及兩對(duì)蛋白，即PS/PSGL-1、CD40/CD40L。 PLT-WBC 相互反應(yīng)促使血小板、白細(xì)胞相互聚集、活化，并釋放炎性遞質(zhì)，參與炎癥反應(yīng)，繼而與斑塊的形成、破裂及血栓的形成密切相關(guān)。 痰、瘀作為胸痹心痛的主要病理因素，與西醫(yī)冠心病的斑塊、血栓形成有共同點(diǎn)。 結(jié)果顯示，觀察組PS/PSGL-1、CD40/CD40L 的表達(dá)明顯高于健康組，說(shuō)明PS/PSGL-1、CD40/CD40L 水平的升高， 在冠心病合并頸動(dòng)脈斑塊發(fā)病中有臨床意義，可用于評(píng)價(jià)PLT-WBC 相互反應(yīng)的程度； 觀察組均為痰瘀互結(jié)氣郁證患者， 其PLT-WBC 相關(guān)參數(shù)均高于非痰瘀互結(jié)氣郁證的對(duì)照組， 因此可以推測(cè)PLT-WBC 相關(guān)參數(shù)與痰瘀互結(jié)氣郁證可能存在一定關(guān)聯(lián)。

體外試驗(yàn)顯示[8]，PS 的增加并不會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生逆轉(zhuǎn)，因此PS 被認(rèn)為是血小板活化的“金標(biāo)準(zhǔn)”。 在血栓性疾病中，通常只有小部分的血小板被活化；凝血酶體外活化血小板，也常表現(xiàn)為亞群激活； 活化的血小板表達(dá)CD62 等膜糖蛋白也有明顯的異質(zhì)性[9]。 而有研究表明[10]，PS 不斷從外周血血小板上脫落進(jìn)入血漿， 隨著血小板保存時(shí)間的延長(zhǎng)，血漿內(nèi)可溶性PS 濃度升高，這可能是解釋可溶性PS 與血小板體內(nèi)存活期相關(guān)性差的理由之一。

CD40L 作為主要表達(dá)于活化的T 細(xì)胞血小板上的跨膜蛋白，它也以可溶性的形式從細(xì)胞上脫落進(jìn)入血循環(huán)。研究結(jié)果顯示[11]，血小板活化后可釋放微泡， 血小板微泡是循環(huán)血中CD40L 的來(lái)源之一，在誘發(fā)炎癥反應(yīng)后微泡上有CD40L 表達(dá)。通過(guò)高速離心將可溶性CD40L 和與囊泡結(jié)合的CD40L 分開(kāi)，酶聯(lián)免疫法雖然可檢測(cè)微泡上的CD40L，但僅能觀察炎癥反應(yīng)發(fā)生后其濃度增加的發(fā)展趨勢(shì)。 而流式細(xì)胞術(shù)不但可明確CD40L 的來(lái)源，而且在檢測(cè)CD40L 的表達(dá)上更為精準(zhǔn)。

本次研究通過(guò)對(duì)同指標(biāo)不同檢測(cè)方法的對(duì)比看出， 流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)比酶聯(lián)免疫法更加精確。且血小板作為血栓形成的重要來(lái)源， 極易活化，循環(huán)中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞對(duì)其活化均有影響。 抗凝劑的選擇、離心、標(biāo)本處理不當(dāng)?shù)榷加锌赡軐?dǎo)致醫(yī)源性血小板激活從而影響診斷價(jià)值。 流式細(xì)胞術(shù)因其標(biāo)本處理的簡(jiǎn)化、直接標(biāo)記血細(xì)胞從而不受其他種類細(xì)胞或碎片的干擾、 能靈敏地檢測(cè)少到1%活化血小板亞群使得檢測(cè)結(jié)果更加真實(shí)等優(yōu)點(diǎn)，已成為靈敏、準(zhǔn)確、快速且能運(yùn)用于臨床常規(guī)檢測(cè)血小板膜糖蛋白的表達(dá)，評(píng)價(jià)血小板功能的首選方法。

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