關寧，王超，霍曉川，顧立學，羅俊生

（遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院神經外科，遼寧 錦州 121001）

膽固醇脂水解酶（human cholesteryl ester hydro?lase，hCEH）存在于人體的各種組織中（肝臟、心臟、肺臟、小腸、脾臟等），以肝臟中含量最多，主要用于水解膽固醇酯為游離膽固醇，并通過細胞表面通道蛋白將游離釋放，減少膽固醇酯在細胞內的蓄積，而ATP結合盒轉運蛋白A1（ATP?binding cassette transporter A1，ABCA1）和ATP結合盒轉運蛋白G1（ATP?binding cassette transporter G1，ABCG1）是細胞膜上兩種主要的轉運蛋白，其中ABCA1能促進膽固醇和磷脂從細胞釋放到載脂蛋白A?Ⅰ（apolipopro?tein A?Ⅰ，apoA?Ⅰ），而ABCG1可以促進膽固醇外流至細胞外高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）受體［1］，從而借助受體蛋白將肝外游離膽固醇運送回肝臟進行最終的清除。本實驗通過先前構建的hCEH重組腺病毒載體［2］，轉染RAW 264.7小鼠單核巨噬細胞，觀察hCEH對泡沫細胞的影響及hCEH上調ABCA1和ABCG1表達的相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

RAW 264.7小鼠單核巨噬細胞株購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，Lenti?hCEH?IRES?EGFP慢病毒載體由本實驗室構建，DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司，氧化型低密度脂蛋（ox?LDL）購自北京協(xié)生生物科技有限公司，RIPA裂解液、BCA、PMSF蛋白濃度測定試劑盒，內參照β?actin購自Santa Cruz公司，ABCA1兔多克隆一抗、ABCG1兔多克隆一抗、羊抗人CEH一抗均購自Abcam公司。

1.2 單核巨噬細胞培養(yǎng)與慢病毒轉染

將RAW 264.7小鼠單核巨噬細胞株置于無菌培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。將處于對數生長期的RAW 264.7細胞進行胰酶消化，制成細胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞融合度達80%分別加入100 μL目的及對照病毒液，同時加入終濃度為8 μg/mL的佛波酯促進感染。同時設立hCEH組（vector組）作為對照。

1.3 細胞泡沫化

取轉染后的細胞進行實驗，將細胞密度調整為1×106/mL，加入6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。加入ox?LDL，濃度為100 mg/L，與單核巨噬細胞共同孵育，誘導其泡沫化。

1.4 油紅O染色和脂質染色的半定量分析

分別于4 h、8 h、12 h和16 h用10%甲醛將細胞固定細胞，再用油紅O方法染色10 min，蘇木素染色5 min，1%HC1分色及返藍后，水洗5 min水性封片劑封片并照相。按Wads［3］方法進行脂質染色的半定量分析，即細胞內脂滴面積＆lt;細胞核面積記為“-”，細胞內脂滴面積≥細胞核面積記為“+”，每孔計數100個細胞。

1.5 高效液相色譜（high performance liquid chro?matography，HPLC）法

各組細胞處理結束后去除培養(yǎng)基，PBS液沖洗3遍，反復凍融細胞，并在冰浴中用超聲裂解。膽固醇使用外標法峰面積定量細胞蛋白（mg/g）。色譜條件為色譜柱：C18；流動相：異丙醇∶正庚烷∶乙腈（35∶12∶52，v/v），非梯度洗脫，流速為1 mL/min；檢測波長為210 nm，檢測到第8分鐘，柱溫保持20℃。用CEH水解膽固醇酯得總膽固醇量，以HPLC測定膽固醇并定量，以“總膽固醇量-游離膽固醇量”代表膽固醇酯的含量（mg/g）。

1.6 Western blot檢測CEH、ABCA1、ABCG1蛋白質的表達

經泡沫化處理后，將細胞用細胞刮刀刮下，收集至EP管內。用TBS漂洗后加入RIPA緩沖液（1%NP40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS，0.1%PMSF）裂解細胞。于4℃離心10 min，棄除沉淀，用BCA法進行蛋白質定量。加熱使蛋白質變性，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，麗春紅染色觀察轉移效果，并確定蛋白質分子量標準位置。5%脫脂奶粉封閉過夜，分別加入1∶200稀釋的羊抗人CEH一抗、1∶500 ABCA1兔多克隆一抗、1∶2 500 ABCG1兔多克隆一抗，β?actin作為內參，4℃培育過夜。TBST洗膜后加入FITC一標記的羊抗兔二抗或辣根過氧化物酶標記的驢抗羊二抗。溫育l h，TBST洗膜后進行BCIP/NBT顯色，采用Chemi?genius凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白的表達量。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 hCEH在RAW 264.7小鼠單核巨噬細胞中的表達

Lenti?hCEH?IRES?EGFP慢病毒轉染RAW 264.7小鼠單核巨噬細胞后，在24 h便可以觀察到少量的細胞有熒光表達，48 h后明顯增加，72 h接近50%，熒光細胞數最多。我們應用Western blot技術檢測慢病毒轉染后hCEH mRNA在巨噬細胞的表達，結果可見，hCEH蛋白大量表達，而vector組無條帶（圖1）。

圖1 Western blot分析hCEH蛋白質的表達Fig.1 Protein expression of hCEH by Western blot

2.2 hCEH對細胞膽固醇代謝的影響

油紅O染色結果顯示：0 h，陽性染色細胞遍布，細胞質紅染，細胞核呈藍染，且細胞體積增大，呈圓形或不規(guī)則形；4 h，胞質紅染變淡；8 h，油紅O染色陽性細胞大量減少，細胞核藍染，隨后陽性細胞越來越少，逐漸消失，見圖2。油紅O染色0 h、4 h、8 h、12 h、16 h陽性細胞分別為（86.70±3.19）%、（46.50±1.62）%、（15.64±2.57）%、（13.68±2.60）%、（12.73±1.47）%。與4 h比較，8 h、12 h和16 h陽性細胞差異有統(tǒng)計學意義（P＆lt;0.05）；而12 h和16 h比較陽性細胞差異無統(tǒng)計學意義（P＆gt;0.05）。

圖2 油紅O染色示不同時間段ABCA1和ABCG1表達對巨噬細胞泡沫化的影響 ×400Fig.2 The change of foam cells were detected at 0，4，8，12，16 hour after the formation of foam cell，Oil Red O stain was used to visualize lipid droplets in foam cells×400

HPLC檢測結果顯示：隨著時間增加細胞內膽固醇酯、游離膽固醇和總膽固醇含量逐漸下降，與4 h比較，8 h、12 h、16 h膽固醇酯、游離膽固醇和總膽固醇含量下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＆lt;0.05），而12 h、16 h指標比較差異無統(tǒng)計學意義（P＆gt;0.05），見表2。

表2 高效液相色譜分析不同時間段游離膽固醇、膽固醇酯和總膽固醇含量（mg/g）Tab.2 The cellular free cholesterol，total cholesterol and cholesterol ester by HPLC（mg/g）

2.3 ABCA1和ABCG1對細胞膽固醇代謝的影響

Western blot結果顯示：ABCA1和ABCG1表達逐漸增加，8 h達高峰，之后逐漸減少，見圖3。

圖3 Western blot分析不同時間段ABCA1和ABCG1蛋白質的表達Fig.3 Protein expression of ABCA1 and ABCG1 by Western blot

3 討論

動脈粥樣硬化的防治從宏觀角度看，膽固醇逆行轉運（reverse cholesterol transport，RCT）過程將肝外游離膽固醇運送回肝臟并最終清除；從微觀角度看，細胞表面通道蛋白（如ABCA1和ABCG1）的表達，在不同程度上也促進了RCT的進程。然而，膽固醇穩(wěn)態(tài)的維持是通過許多途徑來調節(jié)的，清道夫受體CD36和SR?A相關聯(lián)的膽固醇內流起到很重要的作用，但維持這種穩(wěn)態(tài)最重要的途徑是膽固醇外流，包括水溶擴散和細胞膜微溶解，內生的載脂蛋白E，細胞外膽固醇受體apoA?Ⅰ和HDL，ATP結合盒轉運體ABCA1和ABCG1均有效地增加了膽固醇外流［4］。這種膽固醇攝取和排出的平衡一旦打破，泡沫細胞就會在動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展中大量產生［5］。

ABCA1和ABCG1都是LXR轉錄因子的作用靶點，均需要消耗ATP作為能量運輸血脂和其他代謝產物。有研究表明，用米非司酮（ABCA1的激動劑）處理轉染ABCA1細胞后，膽固醇的流出會顯著增加，而沒有加入apoA?Ⅰ或者未經過米非司酮處理的細胞膽固醇流出無明顯增加［6］，說明ABCA1通過apoA?Ⅰ發(fā)揮作用。OX?LDL能使巨噬細胞內膽固醇的流出增多，而HDL是清除過多膽固醇的重要受體。使用3H?膽固醇與轉染ABCG1的細胞和血漿膽固醇共孵育，發(fā)現這一過程中，膽固醇不是流出到apoA?Ⅰ，而是流出到HDL上［7，8］，說明ABCG1是通過HDL起作用。

ABCA1和ABCG1在巨噬細胞的RCT過程中起重要的作用。增加巨噬細胞的ABCA1和ABCG1蛋白表達水平后，在糞便和血漿中的膽固醇有明顯增加。用藥物抑制ABCAl介導的膽固醇流出途徑，膽固醇流出量下降了40%；檢測敲除ABCG1基因的小鼠，膽固醇流出量比正常下降 15%［9，10］。

本實驗成功將hCEH轉染入RAW 264.7小鼠單核巨噬細胞，應用Western blot技術檢測到轉染Lenti?hCEH?IRES?EGFP后hCEH蛋白在小鼠單核巨噬細胞的表達。泡沫化的hCEH組隨著時間增加油紅O染色陽性細胞比例逐漸減少，HPLC顯示細胞內膽固醇酯、游離膽固醇和總膽固醇含量逐漸下降，在8 h，游離膽固醇含量由4 h的（27.46±1.32）mg/g降至（19.59±2.96）mg/g，膽固醇酯含量由4 h的（31.31±4.26）mg/g降至（9.34±1.35）mg/g，差異有統(tǒng)計學意義（P＆lt;0.05），說明在8 h，膽固醇酯降解、游離膽固醇流出增加。然而，Western blot結果顯示：在8 h，AB?CA1和ABCG1的表達顯著增加，說明ABCA1和ABCG1可以有效減少膽固醇酯在細胞內聚集并加強游離膽固醇的流出，抑制細胞泡沫化。

本實驗表明，ABCA1和ABCG1是炎癥和RCT之間的分子基礎，而hCEH mRNA的表達對這一過程起到了激活作用，不斷促進膽固醇外流，抑制動脈粥樣硬化的形成，從而減少心腦血管梗死的發(fā)生。

［1］Fitzgerald ML，Mujawar Z，Tamehiro N，et al.ABC transporter，ath?erosclerosis and inflammation［J］.Atherosclerosis，2010，211（2）：361-370.

［2］關寧，羅俊生，霍曉川，等.hCEH基因慢病毒載體構建及鑒定［J］.軍醫(yī)進修學院學報，2012，33（12）：1303-1305.

［3］Wada Y，Sugiyama A，Yamamoto T，et al.Lipid accumulation in smooth muscle cells under LDL loading is independent of LDL re?ceptor pathway and enhanced by hypoxic conditions［J］.Arterio?scler Thromb Vasc Biol，2002，22（10）：1712-1719.

［4］Meurs L，Lammers B，Zhao Y，et al.The effect of ABCG1 deficiency on therosclerotic lesion development in LDL receptor knockout mice depends on the stage of atherogenesis［J］.Atherosclerosis，2012，221（1）：41-47.

［5］Williams KJ，Feig JE，Fisher EA.Rapid regression of atherosclero?sis：insights from the clinical and experimental literature［J］.Nat Clin Pract Cardiovasc Med，2008，5（2）：91-102.

［6］Vedhachalam C，Liu L，Nickel M，et a1.Influence of ApoA?I struc?ture on the ABCA1.Mediated efflux of cellular lipids［J］.J Biol Chem，2004，279（48）：49931-49939.

［7］Xu M，Zhou H，Tan KC，et a1.ABCG1 mediated oxidized LDL?de?rived oxysterol efflux from macrophages［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，390（4）：1349-1354.

［8］Wang N，Lan D，Chen W，et a1.ATP?binding cassette transporters G1 and G4 mediate cellular cholesterol efflux to high?density lipo?pr0teins［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（26）：9774-9779.

［9］郭贅婧，曹進.ABCA1和ABCG1在膽固醇逆轉運中作用的研究進展［J］.國外醫(yī)學醫(yī)學地理分冊，2012，33（3）：213-217.

［10］Wang X，Collins HL，Ranalletta M，et a1.Macrophage ABCA1 and ABCG1，but not SR?BI，promote macrophage reverse cholesterol transport in vivo［J］.J Clin Invest，2007，117（8）：2216-2224.