冀偉，劉瑞，常亮，于源華

（1.長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022；2.長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，長(zhǎng)春 130013）

根據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)部的調(diào)查報(bào)告顯示，全國(guó)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)被重金屬污染的污水灌區(qū)占總體面積的64.8%以上［1］。每年的全國(guó)糧食總產(chǎn)量由于耕種用的土地受到重金屬的污染而導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)200億元，相當(dāng)于每年4000多萬(wàn)人失去基本生存用糧［2］。因此，對(duì)重金屬污染的檢測(cè)與治理刻不容緩。鉛作為重金屬中的一員，是被記載最多的有毒物質(zhì)之一。城市環(huán)境鉛污染主要來(lái)源于汽油燃燒產(chǎn)生的廢氣，含鉛涂料，采礦、冶煉、鑄造等工業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)，食品和水的鉛污染，以及含鉛殺蟲(chóng)劑、污泥施用于農(nóng)業(yè)土壤等［3，4］。通過(guò)空氣、飲水、食物進(jìn)入生物體的鉛會(huì)不斷積累，超過(guò)一定量時(shí)便會(huì)引起各種疾病。處理重金屬污染的傳統(tǒng)方法多為物理化學(xué)法，如化學(xué)沉淀法、離子交換法、反滲透法等，存在投資大、能耗高、操作困難、易產(chǎn)生二次污染等缺點(diǎn)［5］。隨著微生物學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)明了具有操作簡(jiǎn)單、投資少、污染小、專(zhuān)一性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)的生物修復(fù)技術(shù)，在去除環(huán)境重金屬方面具有廣闊的應(yīng)用前景。一般情況下，在受重金屬污染的地區(qū)都可篩選到抗重金屬的微生物，這些抗性微生物有潛在的重金屬吸附作用。因此，用重金屬選擇培養(yǎng)基，從中篩選出對(duì)土壤重金屬具有專(zhuān)性高效富集作用的菌株，并進(jìn)行分類(lèi)鑒定，是微生物修復(fù)技術(shù)應(yīng)用的前提［6］。

隨著微生物學(xué)的進(jìn)步與發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)像肺炎克雷伯氏菌［7］、浮游球衣菌［8］、Norcardia-amarae［9］、Phanerochaete chrysosportum［10］、Enterobacter sp.J1［11］、芽孢桿菌［12］、短小芽胞桿菌［13］、啤酒酵母菌［14］、拉微球菌［15］、鐮刀霉菌屬［15］、曲霉［16］、根霉［17］、靑霉［18］等微生物都具有一定的抗鉛能力，但耐受能力普遍較低，大都小于400mg/L。本實(shí)驗(yàn)旨在尋找一種能抗高濃度鉛離子的微生物，并對(duì)其生物學(xué)特征進(jìn)行研究，將其鑒別并分類(lèi)，為鉛污染的檢測(cè)與治理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

樣品取自長(zhǎng)春市綠園區(qū)電鍍廠附近的土壤。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10gl/L，酵母浸粉5gl/L，NaCl，10gl/L。

固體LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10gl/L，酵母浸粉5gl/L，NaCl 10gl/L，瓊脂粉15g/L。

選擇培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中分別加入Pb（NO3）2，使其終濃度分別為200mg/mL，300mg/mL，400mg/mL，500mg/mL，600mg/mL直至2000mg/mL。

1.3 菌株的篩選

稱取1g電鍍廠附近的土樣制成不同稀釋度的土壤稀釋液；吸取200μL土壤稀釋液，分別涂布在含有 100mg/mL Pb（NO3）2的固體 LB 平板上，靜置15min，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h；根據(jù)菌落不同形態(tài)，挑取平板上的單菌落到5mL含有100mg/mL Pb（NO3）2的液體LB培養(yǎng)基中，37℃，180rpm/min，振搖培養(yǎng)13h；將獲得的菌懸液反復(fù)涂布平板培養(yǎng)，直至革蘭氏染色鏡檢為單一菌落，接種于液體LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm/min，振搖培養(yǎng)12～14h。

取培養(yǎng)后的菌懸液500μL接種到5mL含有100mg/mL Pb（NO3）2的液體LB培養(yǎng)基中，37℃，180rpm/min，振搖培養(yǎng)13h后，再將培養(yǎng)后的菌懸液接種至含有200mg/mL的Pb（NO3）2液體LB培養(yǎng)基中，相同條件培養(yǎng)；以此類(lèi)推，至Pb（NO3）2的終濃度為 2000mg/mL，最終獲得適應(yīng)高濃度Pb（NO3）2的菌種，命名為FP 2000進(jìn)行保存菌種。

1.4 革蘭氏染色鑒定

用革蘭氏染色法對(duì)FP2000菌進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察微生物形態(tài)。

1.5 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

取FP2000菌懸液100μL，接種在10mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃恒溫條件下，180rpm/min振搖培養(yǎng)13h；取250μL的菌懸液分別接種到16支相同并編號(hào)的裝有5mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃，180rpm/min，振搖培養(yǎng)；分別于time（h）=0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5時(shí)取出一管，測(cè)定不同時(shí)間菌懸液的OD595值，繪制其生長(zhǎng)曲線。并以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，OD595值為縱軸作圖。

1.6 最適生長(zhǎng)溫度測(cè)定

將活化后的菌懸液按1∶50的比例分別接種于5ml液體LB培養(yǎng)基的試管中，分別于27℃，28℃，29℃，30℃，31℃，32℃，33℃，34℃，35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃，41℃，42℃，43℃條件下，180rpm/min，振搖培養(yǎng)5h后取出菌懸液，分別測(cè)定菌懸液OD595值，并繪制出FP 2000的最適生長(zhǎng)溫度曲線。

1.7 最適生長(zhǎng)pH值測(cè)定

配制pH值分別為5，6，7，8，9的LB液體培養(yǎng)基，取250μL菌懸液接種于5mL的LB培養(yǎng)基中，37℃，180rpm/min，振搖培養(yǎng)5h后，分別測(cè)定菌懸液OD595值，并繪制出FP 2000的最適pH值曲線。

1.8 對(duì)Pb2+等有毒重金屬離子的耐受性測(cè)定

為了探究FP 2000的對(duì)其他重金屬的抵抗能力，本實(shí)驗(yàn)用FP 2000對(duì)Cd2+，Ag+，Zn2+，Ni2+，Cu2+重金屬的敏感性進(jìn)行了測(cè)試。分別配制含有終濃度為100mg/mL，500mg/mL，1000mg/mL和2000mg/mL的Pb2+，Cd2+，Ag+，Zn2+，Ni2+，Cu2+的LB液體培養(yǎng)基，將活化的菌懸液和對(duì)照組普通BL 21大腸桿菌按1：50的比例接種于5mL LB培養(yǎng)基中，37℃，180rpm/min，振搖培養(yǎng)5h后，分別測(cè)定菌懸液吸光度OD595的數(shù)值，并繪制出在不同濃度下，F(xiàn)P 2000的對(duì)不同金屬的耐受性。

1.9 16S rDNA分析

16S rDNA的PCR擴(kuò)增：提取FP 2000菌的基因組DNA，以細(xì)菌的總DNA為模板，克隆引物采用上海生工公司16S rDNA通用引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACT T-3’和 27F：5’-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3’，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)體系（50μL）：DNA模板1μL，10×Taq reaction Buffer 5μL，正向引物8F和反向引物1492各1μL，Taq酶0.25μL，dNTP 1μL，擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃預(yù)變5min，95℃變性35s，55℃復(fù)性35s，72℃延伸90s，循環(huán)3次，最后72℃延伸8min（16S rDNA序列的測(cè)定由上海生工生物技術(shù)有限公司完成）。根據(jù)測(cè)序得出的結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，對(duì)FP 2000菌進(jìn)行鑒定。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 FP 2000的分離、篩選和鑒定

對(duì)篩選的FP 2000進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察。觀察到結(jié)果為FP 2000染色后呈短棒狀紅色細(xì)菌（見(jiàn)圖1），因此判定該菌為革蘭氏陰性菌。

圖1 FP 2000菌革蘭氏染色40x鏡檢結(jié)果

2.2 菌生長(zhǎng)條件的測(cè)定

2.2.1 生長(zhǎng)曲線

以FP 2000的生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度OD595的值為縱坐標(biāo)，并繪制生長(zhǎng)曲線，如圖2。從生長(zhǎng)曲線來(lái)看，F(xiàn)P 2000在3～7h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，7～9h，細(xì)菌生長(zhǎng)達(dá)到遲緩期，9h以后為衰亡期。

圖2 FP2000菌的生長(zhǎng)曲線

2.2.2 最適生長(zhǎng)溫度

以細(xì)菌生長(zhǎng)溫度為橫坐標(biāo)，吸光度OD595的值為縱坐標(biāo)，繪制FP 2000菌的最適生長(zhǎng)溫度曲線，如圖3所示，可以看出FP 2000菌的最適溫度為34℃～40℃。

圖3 FP 2000菌的最適生長(zhǎng)溫度

2.2.3 最適生長(zhǎng)pH值

以不同pH值為橫坐標(biāo)，吸光度OD595的值為縱坐標(biāo)，并繪制FP 2000菌的最適pH生長(zhǎng)曲線，如圖4，從圖中可以看出該菌株的最適生長(zhǎng)pH為4.5-6，當(dāng)pH值大于7時(shí)，生長(zhǎng)速度迅速下降。原因是鉛需要在酸性條件下才能以鉛離子形態(tài)存在，因此抗鉛離子的菌株也能適應(yīng)酸性生長(zhǎng)條件。

圖4 FP 2000菌的最適生長(zhǎng)pH值

2.2.4 不同重金屬的耐受性

圖5表示出了FP 2000的抗鉛能力，圖中所反映的是BL 21大腸桿菌和FP 2000在不同濃度Pb2+的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況，可以看出，在Pb2+濃度較低（0mg/L和100mg/L）時(shí)，37℃，180rpm培養(yǎng)5h后，在595nm下測(cè)得的OD值在1.3-1.7之間，生長(zhǎng)狀況差異比較小，但隨著Pb2+濃度升高（100mg/L和2000mg/L），兩種菌在595nm下測(cè)得的OD值都有所下降，BL 21大腸桿菌的生長(zhǎng)明顯受到了Pb2+的抑制，而FP 2000菌生長(zhǎng)的OD值下降速度較緩，在1.0以上，說(shuō)明FP 2000菌具有對(duì)Pb2+的抗性，并可在Pb2+濃度達(dá)2000mg/L的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)。

圖5 FP 2000菌的抗鉛能力

如圖6、圖7所示，重金屬的濃度較低（100mg/L）時(shí)Pb2+、Zn2+和Ni2+離子對(duì)該菌的生長(zhǎng)影響很小，在5h后吸光度與對(duì)照組差別并不大，而Cd2+和Ag+則明顯影響了該菌的正常生長(zhǎng)；當(dāng)金屬離子濃度較高時(shí)（500mg/L）時(shí)，Cd2+，Ag+，Zn2+，Ni2+對(duì)該菌的抑制作用比較明顯，菌液的吸光度均小于1.0，而Pb2+對(duì)該菌生長(zhǎng)狀況影響不大，這說(shuō)明FP 2000菌對(duì)Pb2+具有抗性的，而對(duì)Cd2+，Ag+，Zn2+，Ni2+抗性較低。

圖7 FP 2000菌對(duì)高濃度重金屬的耐受性

2.3 FP 2000菌16S rDNA的提取及鑒定

將測(cè)序獲得的16S rDNA序列美國(guó)基因數(shù)據(jù)庫(kù)（Gen-Bank）比對(duì)，對(duì)獲得的同源序列進(jìn)行序列分析，采用MEGA 5.05軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。如圖8所示。該菌的16S rDNA序列與克雷伯氏菌同源性達(dá)到99%，因此可以判定FP 2000菌屬于克雷伯氏菌。

圖8 FP 2000菌系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 結(jié)論

從電鍍廠附近的土壤中，分離、篩選出1株高對(duì)濃度為2000mg/L的Pb（NO3）2具有抵抗能力的細(xì)菌：FP 2000。對(duì)FP 2000該菌進(jìn)行革蘭氏染色，并對(duì)該菌株16S rDNA進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，結(jié)果表明：FP 2000為革蘭氏陰性菌，該菌是歸屬于克雷伯氏菌；并對(duì)該菌進(jìn)行條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，最適合的生長(zhǎng)條件為：溫度34～40℃，pH值4～6，在普通LB液體培養(yǎng)基中3～7小時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以上結(jié)論說(shuō)明該菌對(duì)環(huán)境條件要求較低，有很好應(yīng)用前景。

對(duì)于該菌的耐鉛機(jī)制，目前還不清楚。今后將開(kāi)展對(duì)菌株降解動(dòng)力學(xué)、降解途徑、細(xì)菌降解后產(chǎn)物以及降解含丙烯酰胺污水的室內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。

［1］王?；?，郇恒福，羅瑛，等.土壤重金屬污染及植物修復(fù)技術(shù)［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)報(bào)，2009，25（11）：210-214.

［2］夏利亞.土壤中金屬污染及防治對(duì)策［J］.能源環(huán)境保護(hù)，2011，25（4）：54-55.

［3］Farfel M R，Chisolm J J.Health and environmental outcomes of tradition anmodified ractices for abatement of residential Lead-base paint［J］.Am J Public Health，1990，80：1240-1245.

［4］Orlova AO，Bannon DL，F(xiàn)arfel MR，et a1.Pilot study of sources of Lead exposure in Moscow，Russia［J］.Environmental Geochemistry and Health，1995，17：200-210.

［5］姜華，魏曉晴，胡曉靜.抗重金屬霉菌的篩選鑒定及其特性研究［J］.遼寧師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（1）：100-103.

［6］楊亮，郝瑞霞，吳灃，等.耐鉛微生物篩選及其鉛去除能力的初步研究［J］.北京大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，48（6）：965-966.

［7］陳吉群.耐鉛優(yōu)勢(shì)菌的篩選及其吸附應(yīng)用研究［D］.大連：大連理工大學(xué)，2007：1-20.

［8］秦玉春，關(guān)曉輝，魏德洲，等.浮游球衣菌的分布對(duì)其鉛離子的吸附性能［J］.東北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，26（7）：687-690.

［9］朱一民，周東琴，魏德洲.Norcardiaamarae菌體對(duì)水相中Pb2+的吸附特性［J］.東北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，24（10）：978-981.

［10］Iqbal M，Edyvean R G J.Biosorption of lead，copperand zinc ions on loofa sponge immobilized biomass of Phanerochaete chrysosporium［J］.Miner Eng，2004，17：217-223.

［11］Lu W B，Shi J J，Wang C H，et al.Biosorption of lead，copper and cadmium by an indigenous isolateEnterobacter sp.J1 possessing high heavy-metalresistance［J］.Journal of Hazardous Materials，2006，B134：80-86.

［12］李青彬，韓永軍，劉雪平，等.土壤分離菌株去除水溶液中鉛離子研究［J］.環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2007，1（3）：70-73.

［13］任廣明，曲娟娟.鉛抗性細(xì)菌的分離及吸附性能研究［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41（2）：55-59.

［14］周東琴，朱一民，魏德洲.啤酒酵母菌對(duì)Pb2+和Zn2+的生物吸附規(guī)律［J］.東北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，41（2）：55-59.

［15］周薇，張小平，康紀(jì)婷.從礦區(qū)土壤中篩微生物對(duì)Pb2+、Zn2+吸附的研究［J］.環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2009，3（10）：1906-1910.

［16］王俊麗，王忠，任建國(guó).耐鉛微生物的篩選及其吸附能力的初步研究［J］.污染防治技術(shù)，2010，23（1）：15-17，63.

［17］Tolga B，Gulfem B，Levent A，et al.The investigationof lead removal by biosorption：an application atstorage battery industry wastewaters［J］.Enzyme and Microbial Technology，2007，41：98-102.

［18］潘蓉，曹理想，張仁鐸.青霉菌和鐮刀菌對(duì)重金屬Cd2+、Cu2+、Zn2+和Pb2+的吸附特性［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（3）：477-484.